폐 선암과 관련된 원발성 쇼그렌 증후군: 잠재적인 공통 병원성 메커니즘 조사 및 실험적 검증

요약

이 원고는 생물정보학 분석 및 실험적 검증을 통해 원발성 쇼그렌 증후군과 폐 선암을 연결하는 잠재적인 공통 병원성 메커니즘을 조사하기 위한 운영 절차와 예방 조치를 설명합니다.

초록

이 연구는 생물정보학 분석 및 실험적 검증을 통해 원발성 쇼그렌 증후군(pSS)과 폐 선암(LUAD)을 연결하는 잠재적인 공통 병원성 메커니즘을 조사하는 것을 목표로 했습니다. pSS 및 LUAD와 관련된 관련 유전자는 GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스 및 Genecard 데이터베이스에서 검색되었습니다. 그 후, pSS 및 LUAD와 관련된 차등적으로 발현된 유전자(DEG)를 pSS-LUAD-DEG로 스크리닝했습니다. kegg(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 GO(Gene Ontology) 농축 분석을 수행하여 pSS-LUAD-DEG의 중요한 생물학적 기능을 밝혔습니다. 핵심 표적은 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하여 식별되었으며, ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석을 통해 허브 유전자 진단 정확도를 추가로 평가했습니다. 본 연구에서는 NOD/Ltj 마우스를 pSS 동물모델로 삼아 미립자 물질 2.5(PM2.5)를 자극하여 염증 반응을 일으켰다. 관련 분자생물학 실험 검증을 위해 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR), 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 웨스턴 블로팅(western blotting)을 사용했습니다. KEGG 및 GO 농축 분석을 통해 밝혀진 결과는 염증이 pSS와 LUAD를 연결하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 및 CEP55가 pSS-LUAD의 주요 타겟으로 결정되었습니다. BALB/c 마우스와 NOD/Ltj 마우스는 PM2.5로 21일 동안 자극한 후 폐 조직에서 염증성 사이토카인 IL-6 및 IL-1β의 향상된 발현을 보였으며, JAK2/STAT3 신호 경로를 활성화하고 종양 관련 유전자 CCNA2, CCNB2 및 CEP55의 발현을 상향 조절했으며, NOD/Ltj 마우스는 BALB/c 마우스보다 더 뚜렷한 변화를 보였습니다. 이 프로토콜은 폐 염증성 미세환경에 의해 유발된 발암이 pSS 환자에서 LUAD 발병률이 높은 주요 원인일 수 있음을 보여줍니다. 또한 차단 관련 메커니즘은 pSS 환자에서 LUAD의 발생을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

원발성 쇼그렌 증후군(primary Sjögren's syndrome, pSS)은 림프구가 외분비선에 침투하는 것이 특징인 자가면역 질환으로, 안구건조증(안구건조증)과 구강건조증(구강건조증)의 임상 증상을 유발합니다^1,2. pSS는 또한 일반적으로 고글로불린혈증(hyperglobulinemia)³, 간질성 폐질환(interstitial lung disease)⁴, 신세뇨관산증(renal tubular acidosis)⁵, 신경학적 손상(neurological damage⁾⁶, 혈소판 감소증(thrombocytopenia)⁷ 등 주요 악예 인자인 혈소판 감소증(thrombocytopenia)7을 포함한 선외 침범 증상을 동반한다. 최근 몇 년 동안 여러 연구에서 pSS가 일반적으로 혈액 악성 종양 및 고형 종양을 포함한 암 유병률 증가를 동반한다는 사실이 입증되었습니다 ^8,9,10. 폐암은 가장 흔한 pSS 관련 암 중 하나이며, 특히 폐선암종(LUAD)¹¹.

종합적으로, 추가 조사는 LUAD를 사용한 pSS가 몇 가지 근본적인 공통 발병 기전을 가질 수 있음을 시사했습니다. 현재 우리가 알고 있는 지식에 따르면, 두 질병 사이의 공통적인 메커니즘을 설명하는 특별한 연구는 아직 없다. 최근 생물정보학 분석은 12,13,14종 전반에 걸쳐 잠재적으로 공유되는 질병 메커니즘을 밝힐 수 있는 잠재적인 가능성을 제공합니다. 기본 메커니즘을 더 자세히 밝히기 위해 생물정보학 분석은 pSS와 LUAD 사이의 공통 표적 및 신호 전달 경로를 분석하는 데 사용되며, 이후 실험 검증을 위해 동물 모델을 확립합니다. 이러한 메커니즘을 밝히는 것은 pSS 환자에서 LUAD의 임상적 예방을 위한 증거 기반을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 연구는 GEO 및 Genecard 데이터베이스를 사용하여 pSS 및 LUAD와 관련된 관련 유전자를 검색했습니다. 그 후, pSS 및 LUAD와 관련된 DEG를 pSS-LUAD-DEG로 스크리닝했습니다. pSS-LUAD-DEG의 중요한 생물학적 기능을 규명하기 위해 KEGG 및 GO 농축 분석을 수행했습니다. 핵심 표적을 식별하기 위해 PPI 네트워크 구축을 사용했으며, ROC 곡선 분석을 통해 허브 유전자 진단 정확도를 추가로 평가했습니다. NOD/Ltj 마우스를 미립자 물질 2.5(PM2.5)로 자극하여 염증 반응을 일으키는 pSS 동물 모델로 사용했습니다. QPCR, ELISA 및 웨스턴 블로팅을 수행하여 연구를 실험적으로 검증했습니다. 전반적으로, 본 연구 결과는 폐 염증성 미세환경에 의해 유발된 발암이 pSS 환자에서 LUAD의 높은 발병률에 대한 결정적인 이유일 수 있음을 시사한다. 또한 pSS 환자에서 LUAD의 발생은 차단 관련 메커니즘에 의해 예방될 수 있음을 시사합니다.

프로토콜

실험 동물들은 중국-일본 우호 병원의 동물 시설에 수용되었으며, 중국의 국가 표준인 환경 및 사육 시설의 실험실 동물 요구 사항(GB14925-2010)에 따라 동물 사육 환경이 충족되었습니다. 모든 동물 관리 절차 및 실험은 ARRIVE 지침을 준수했으며 중국 국가 동물 복지법의 지침을 준수하는 3R 원칙(감소, 교체, 개선)을 기반으로 했습니다. BALB/c 마우스는 SPF(Beijing) Biotechnology Co., Ltd.에서, NOD/Ltj 마우스는 Huafukang(Beijing) Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다.

1. 생물정보학 분석

1. 데이터 세트 준비
   1. 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)¹⁵를 열고 원발성 쇼그렌 증후군(primary Sjögren's syndrome) 및 폐 선암종(lung adenocarcinoma)을 키워드로 사용하여 유전자 발현 프로파일을 검색합니다. 그런 다음 GEO 데이터 세트 데이터베이스에서 결과를 클릭하고 Top Organisms에서 Homo sapiens를 선택합니다. 관심 있는 데이터 세트를 선택하고 해당 플랫폼 정보와 함께 다운로드합니다.
   2. Genecard 데이터베이스(https://www.genecards.org/)¹⁶를 열고 primary Sjögren's syndrome 과 lung adenocarcinoma 를 키워드로 사용하여 pSS 및 LUAD의 유전자를 얻습니다. 질병 유전자의 스프레드시트를 다운로드하십시오.
2. pSS와 LUAD 간의 공유 DEG 식별
   1. R 소프트웨어(https://cran.r-project.org/)를 다운로드하여 엽니다^.17. R 소프트웨어에 GEOquery R 패키지, stringr R 패키지, ggplot2 R 패키지, reshape2 R 패키지 및 limma R 패키지를 설치합니다.
   2. R 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 GEO 데이터 세트(GSE84844, GSE51092, GSE32863 및 GSE75037)에서 차등 발현 유전자(DEG)를 식별하고 시각화한 다음 이러한 데이터 세트 간의 유전자 발현을 비교 및 분석합니다. 조정된 P-값이 0.05< 1.2 또는 < 0.83> 폴드 체인지(FC)를 가진 유전자를 DEG로 간주합니다.
   3. Genecard 데이터베이스에서 pSS 및 LUAD와 관련된 발현 수준이 20 이상인 유전자를 선택합니다.
   4. pSS와 연결된 DEG 및 GEO 데이터베이스와 Genecard 데이터베이스 모두에서 LUAD와 연결된 DEG를 병합합니다.
   5. R에서 VennDiagram 패키지를 설치 및 로드하여 pSS 및 LUAD(pSS-LUAD-DEG)와 연결된 DEG를 얻고 시각화합니다.
3. 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 농축 분석
   1. 메타스케이프 진입 (https://metascape.org/)¹⁸. 파일 선택을 클릭하고 pSS-LUAD-DEG의 .xlsx 형식 파일을 업로드합니다. Input as Species에서 H. sapiens를 선택합니다. 마찬가지로, 분석(Analysis as Species)에서 H. sapiens(H. 사피엔스)를 종(Species)으로 선택합니다.
   2. Custom Analysis(사용자 지정 분석)를 클릭합니다. Enrichment(보강)를 클릭하고 KEGG Pathway(KEGG 경로)를 선택합니다. Enrichment Analysis(농축 분석)를 클릭한 다음 농축 분석이 완료되면 Analysis Report Page(분석 보고서 페이지)를 클릭합니다.
   3. All in One Zip File을 클릭하여 결과를 다운로드합니다. 다운로드 Enrichment_GO 폴더의 _ FINAL_GO.csv 파일에 액세스하여 결과를 확인합니다.
   4. ggplot2 패키지를 사용하여 R에서 KEGG 시각화 프로그램을 수행합니다.
4. 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석
   1. R에서 clusterProfiler 및 enrichplot 패키지를 설치하고 로드합니다.
   2. pSS-LUAD-DEG의 텍스트 형식 목록을 R로 가져옵니다.
   3. GO 보강 분석 및 결과 시각화를 위해 clusterProfiler 및 enrichplot 패키지를 실행합니다. 분석에서 통계적 유의성을 조정된 P-값 < 0.05로 정의합니다.
5. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축 및 모듈 분석
   1. STRING(Retrieval of Interacting Genes) 데이터베이스(http://string-db.org/)¹⁹를 입력합니다. 찾아보기를 클릭하고 pSS-LUAD-DEG 파일을 업로드합니다. Organisms(유기체)에서 Homo sapiens(호모 사피엔스)를 선택한 다음 Search(검색)를 클릭합니다.
   2. 계속을 클릭합니다. 결과를 사용할 수 있게 되면 설정을 클릭합니다. 기본 설정 > 최소 필수 상호 작용 점수에서 높은 신뢰도(0.700)를 선택합니다. Advanced Settings(고급 설정)에서 Hide Disconnected Nodes in the Network(네트워크에서 연결이 끊긴 노드 숨기기)를 선택한 다음 Update(업데이트)를 클릭합니다.
   3. 제목 표시줄에서 내보내기 를 클릭하여 PPI 관계 텍스트를 TSV 형식으로 다운로드합니다.
   4. Cytoscape 3.7.1 소프트웨어(https://cytoscape.org/)²⁰를 다운로드하여 켭니다. 파일 > 파일에서 > 네트워크 가져오기 를 클릭하여 PPI 네트워크를 구성하기 위한 TSV 형식 파일을 가져옵니다.
   5. 네트워크 분석기 툴을 사용하여 네트워크의 위상 파라미터를 분석합니다. 왼쪽 제어판의 스타일 표시줄을 통해 노드 크기와 색상을 최적화합니다.
   6. 메뉴 모음에서 Tools > Analyze Network를 선택합니다. Table( 테이블 ) 패널에서 Degree( 차수 )를 클릭하여 구성 요소를 차순으로 내림차순으로 정렬합니다. 더 높은 정도를 가진 상위 20개 유전자를 허브 유전자로 예로 들어 보겠습니다.
   7. R에 igraph 및 ggplot2 패키지를 설치하고 로드하여 허브 유전자를 차수별로 시각화합니다.
6. 허브 유전자의 식별 및 검증
   1. R에서 pROC 패키지를 설치하고 로드합니다.
   2. 허브 유전자의 텍스트 형식 목록을 R로 가져옵니다.
   3. 허브 유전자의 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 플롯하고 AUC(Area Under the ROC Curve) 값을 계산합니다.
      참고: DEG 필터링을 위한 R 코드는 추가 코딩 파일 1 을 참조하십시오.

2. 실험적 검증

참고: 이 프로토콜에 사용되는 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 동물 준비
   1. 9주 된 암컷 BALB/c 마우스 12마리와 9주 된 암컷 NOD/Ltj 마우스 12마리를 1주일 동안 적응적으로 먹이십시오.
   2. 난수 표를 사용하여 9주 된 암컷 BALB/c 마우스 12마리를 빈 대조군과 PM2.5 그룹에 균등하게 할당합니다. 마찬가지로, 생후 9주 된 암컷 NOD/Ltj 마우스 12마리를 pSS 그룹과 pSS-PM2.5 그룹으로 균등하게 나눕니다.
2. 입자상 물질 2.5 (PM2.5) 현탁액의 제조
   참고: PM2.5는 마우스 모델²¹에서 염증 관련 LUAD의 발생 및 발달을 유도할 수 있습니다. BALB/c 마우스와 NOD/Ltj 마우스는 PM2.5에 의해 염증 관련 변화를 일으키도록 유도되었습니다. Piao et ^al.22에 의해 기술된 방법에 따라 PM2.5 현탁액의 농도는 1mg/mL로 준비되었습니다.
   1. PM2.5 석영 섬유막의 무게를 달아 2cm × 2cm 조각으로 자르고 적당량의 탈이온수가 들어있는 비커에 담급니다.
   2. 비커를 밀봉하고 37°C의 수조 초음파 발생기에서 매번 30분 동안 초음파 처리합니다. 입자가 완전히 용해될 때까지 이 과정을 3회 반복합니다.
   3. 16겹의 멸균 의료용 거즈를 통해 비커의 액체를 걸러낸 다음 거즈에 남아 있는 수분을 짜냅니다.
   4. 평평한 접시에 여과액을 놓고 -20°C 냉동고에서 얼음 블록으로 얼립니다. 그런 다음 동결 건조 기기(-52°C, 0.1mbar, 48시간)를 사용하여 여과액의 얼음 블록을 건조시키고 분말 입자를 수집합니다.
   5. 분말 입자를 식염수에 완전히 용해시켜 1mg/mL 농도의 PM2.5 현탁액을 준비합니다. PM2.5 현탁액을 유리병에 붓고 고압 살균기에 넣은 다음 고압과 온도(121°C에서 15분, 15psi)를 가하여 살균합니다.
   6. 초음파 교반을 수행합니다(200W, 교반 10초, 휴식 10초, 3주기 동안). 처리 후에는 나중에 사용할 수 있도록 4°C 냉장고에 보관하십시오.
3. PM2.5 마우스 모델 정립
   참고: PM2.5 그룹과 pSS-PM2.5 그룹은 28일 동안 3일에 한 번씩 기관 점적에 의한 PM2.5 현탁액을 투여받았으며 각 용량은 0.1mL였습니다. 블랭크 대조군과 pSS 그룹은 28일 동안 3일에 한 번씩 기관식염수를 기관식염수로 투여하였으며, 각 용량은 0.1mL였습니다.
   1. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg) 혼합물을 마우스에 주입합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인하고 완전한 근육 이완을 확인하여 마취 수술 평면을 확인합니다. 반사 신경, 호흡 및 전반적인 반응을 지속적으로 모니터링하여 모든 단계가 완료될 때까지 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취가 유지되도록 합니다.
   2. 복부가 위를 향하고 머리는 올라가고 꼬리는 45° 각도로 내려간 상태로 작은 동물 보호장치에 마우스를 놓습니다. 가는 실을 사용하여 마우스의 위쪽 앞니를 둥글게 감싸고 위로 당기고 실을 동물 홀더의 나사에 고정하여 마우스의 구강이 완전히 노출되도록 합니다.
   3. 차가운 빛을 엽니다.amp 쥐의 목 피부에 빛을 비춥니다. 집게를 사용하여 마우스의 혀를 당겨 성문을 완전히 노출시킵니다. 마우스의 구강 내에서 마우스의 기도 개구부 위치를 나타내는 빛의 반복적인 개폐 지점을 관찰합니다.
   4. 18G의 정맥 내주 바늘을 마우스 기관에 삽입하고 바늘 코어를 빼낸 다음 정맥 내주 바늘의 바깥쪽 끝에 면사를 놓고 마우스의 가슴 움직임에 따라 면사가 움직이는 것을 관찰하면서 성공을 확인합니다.
   5. 먼저 1mL 주사기를 사용하여 0.2mL의 공기를 흡입한 다음 0.1mL의 PM2.5 현탁액을 흡입한 다음 0.2mL의 공기를 추가로 흡입합니다. 18G의 정맥 내주 바늘을 통해 혼합물을 기관에 주입합니다.
   6. 18G의 정맥 내주 바늘을 빼냅니다. 동물 사육장을 똑바로 세우고 시계 방향과 시계 반대 방향으로 30회 돌려 PM2.5 현탁액이 쥐의 폐에 고르게 분포되도록 합니다. 그런 다음 마우스의 목을 똑바로 펴고 옆으로 눕혀 질식을 방지합니다.
4. 표본 수집
   참고: 후속 분자 생물학 분석을 위해 실험 29^일 째에 표본을 수집합니다.
   1. 안락사 시스템의 연결을 확인하고 컨트롤러 전원을 켭니다. 이산화탄소(CO₂) 실린더 밸브를 엽니다.
      알림: 동물을 안에 넣기 전에 안락사 챔버를 미리 채우지 마십시오.
   2. 마우스를 챔버에 넣고 분당 챔버 부피의 30%-70%에서 CO₂ 를 주입합니다. 생쥐를 CO₂ 에 5분 동안 노출시켜 움직이지 않고 숨을 쉬지 않으며 동공이 확장되었는지 확인합니다. CO₂ 실린더 밸브를 끄고 5분 더 관찰하여 사망을 확인합니다.
   3. 안락사된 쥐를 깨끗한 해부 보드에 누운 자세로 놓습니다. 기관, 심장 및 폐를 노출시킵니다.
   4. 가위와 집게를 사용하여 복부, 흉부 및 목 부위를 덮고 있는 피부와 근육을 제거합니다. 가위와 집게를 사용하여 흉강 양쪽의 갈비뼈 가장자리를 따라 절개하여 심장과 폐를 포함하는 흉강을 노출시킵니다. 그런 다음 쇄골을 잘라 왼쪽과 오른쪽 폐엽을 철저히 검사할 수 있을 만큼 충분히 넓은 구멍을 만듭니다.
   5. 흉골과 갈비뼈에서 턱까지 뻗어 있는 목 근육을 절제합니다. 갈비뼈 앞쪽 가장자리 아래에 가위를 삽입하고 양쪽을 절개하여 기관을 덮고 있는 뼈 부분을 제거합니다.
   6. 턱 근처의 기관을 겸자로 잡고 집게 위에 놓인 가위를 사용하여 완전히 가로 절개합니다.
   7. 집게로 기관을 부드럽게 당겨 올리고 흉부 조직 전체가 몸에서 제거될 때까지 가위로 복부 조직 연결을 자릅니다.
   8. 작업대에 폐를 평평하게 놓습니다. 폐 조직 표면 잔여물을 식염수로 헹구고 여과지로 닦아내어 건조시킨 다음 극저온 튜브에 부분 표본을 넣고 -80°C에서 보관합니다.
5. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)
   1. 액체 질소가 함유된 모르타르를 사용하여 폐 조직을 가루로 분쇄합니다.
   2. 정밀 저울을 사용하여 분쇄 조직 20mg의 무게를 측정하고, 원심분리기 튜브에서 750μL의 Buffer RL과 결합하고, 와류 믹서를 사용하여 철저히 혼합한 다음 실온(RT)에서 3분 동안 방치합니다. 그런 다음 상온에서 5분 동안 14,000 x g 에서 원심분리하고 상층액을 수집합니다.
   3. 게놈 DNA(gDNA) 필터 미니 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 상층액을 gDNA 필터 미니 컬럼으로 옮기고 RT에서 2분 동안 14,000 x g 로 원심분리합니다.
   4. gDNA 필터 미니 컬럼을 폐기합니다. 여과액에 동일한 부피의 70% 에탄올을 첨가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다.
   5. RNA 미니 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 혼합물 750μL를 RNA 미니 컬럼으로 옮기고 RT에서 1분 동안 12,000 x g 로 원심분리합니다.
   6. 여과액을 버리고 RNA 미니 컬럼을 2mL 수집 튜브에 다시 넣습니다. RNA 미니 컬럼에 500μL의 Buffer RW1을 추가하고 RT에서 1분 동안 12,000 x g 로 원심분리합니다.
   7. 여과액을 버리고 RNA 미니 컬럼을 2mL 수집 튜브에 다시 넣습니다. 500μL의 Buffer RW2를 RNA 미니 컬럼에 추가합니다. 상온에서 12,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기를 합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
   8. 여과액을 버리고 RNA 미니 컬럼을 2mL 수집 튜브에 다시 넣습니다. 12,000 x g 에서 상온에서 2분 동안 원심분리기.
   9. RNA 미니 컬럼을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고, 컬럼 멤브레인 중앙에 RNase가 없는 물 100μL를 추가한 다음 RTase에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 RT에서 1분 동안 12,000 x g 에서 원심분리합니다. RNA 미니 컬럼을 버리고 RNA 용액을 -80°C에서 보관합니다.
   10. RNA 용액 2 μL를 채취하여 장비 설명서에 따라 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 측정하여 농도와 품질을 측정합니다.
       참고: 이 연구는 RNA 품질 관리를 위해 260/280 및 260/230 비율을 선택했습니다.
   11. 총 RNA 1 μg, MgCl₂ 4 μL (25 mM), 역전사 10x 완충액 2 μL, dNTP 혼합물 2 μL (10 mM), 재조합 리보뉴클레아제 억제제 0.5 μL, 역전사효소 15 단위, 올리고(dT)₁₅ 프라이머 0.5 μg, Nuclease-Free Water를 20μL에 추가합니다. 내용물을 부드럽게 혼합하여 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 수집합니다.
       참고: 보다 일관된 cDNA 합성 및 RNA 정량화를 보장하기 위해 칵테일 용액을 준비해야 합니다.
   12. 20 μL RNA 용액을 42 °C에서 15 분 동안 배양하고 95 ° C에서 5 분 동안 변성 한 다음 4 ° C로 냉각 한 다음 -20 ° C에서 보관하여 cDNA로 역 전사합니다.
   13. 6.4 μL의 증류수, 10 μL의 SYBR Green real-time PCR 마스터 믹스, 얻어진 cDNA 용액 2 μL, 0.8 μL의 정방향 프라이머(10 μM) 및 0.8 μL의 역방향 프라이머(10 μM)를 결합하고 철저히 혼합하여 반응 시스템을 제조합니다(표 1).
   14. PCR 기기에서 반응을 실행하여 표적 유전자 및 참조 유전자에 대한 cycle threshold(CT) 값을 얻습니다.
       1. 각 PCR 주기가 시작될 때 95초 동안 60°C에서 초기 변성을 설정합니다.
       2. PCR 주기 동안 95°C에서 15초 동안 변성, 60°C에서 15초 동안 어닐링, 72°C에서 45초 동안 확장을 수행하여 확장 단계 중에 데이터를 수집합니다. 총 40회의 PCR 사이클을 수행합니다.
       3. PCR 사이클을 완료한 후 PCR 기기를 사용하여 자동으로 용융 곡선 분석을 수행합니다.
          참고: 용융 곡선에 이중 피크 또는 불규칙한 피크 모양이 표시되는 경우 이는 실험에 문제가 있을 수 있음을 나타냅니다.
   15. ^2-ΔΔCT 방법을 사용하여 각 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 결정한 후 추가 통계 분석을 수행합니다. ^2-ΔΔCT 방법에 대한 다음 수식 목록을 사용합니다.
       ΔCT (test) = CT (target, test) - CT (ref, test)
       ΔCT (캘리브레이터) = CT (타겟, 캘리브레이터) - CT (ref, 캘리브레이터)
       ΔΔCT = ΔCT (테스트) -ΔCT (교정기)
       ^2-ΔΔCT = 유전자 발현의 폴드 변화

유전자 이름	순서(5"에서 3")
마우스 CCNA2 앞으로	CCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
마우스 CCNA2 반전	TTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
마우스 ASPM 앞으로	CTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
마우스 ASPM 리버스	CCAGGCTTGAATCTTGCAG
마우스 CCNB2 앞으로	TTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
마우스 CCNB2 반전	CTGTTCAACATCAACCTCCC
마우스 NUSAP1 앞으로	CTCCCTCAAGTACAGTGACC
마우스 NUSAP1 반전	TTTAACAACTTGGTTGCCCTC
마우스 CEP55 앞으로	CCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
마우스 CEP55 리버스	아그가트굿궂이굳이

표 1: 정량적 real-time PCR을 위한 프라임 염기서열.

6. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)
   알림: ELISA 키트의 지침에 따라 ELISA 키트를 RT로 평형을 이루고 세척 버퍼를 준비하며 표준물질을 희석합니다. 90μL의 농축된 비오틴화 항체를 8910μL의 비오틴화 항체 희석 완충액으로 희석하여 비오틴화 항체 작업 용액(1:100)을 미리 준비합니다. 마찬가지로, 90μL의 농축 효소 접합체를 8910μL의 효소 접합체 희석 완충액으로 희석하여 효소 접합체 작업 용액(1:100)을 미리 준비합니다.
   1. 액체 질소가 함유된 모르타르를 사용하여 폐 조직을 분말로 분쇄합니다.
   2. 정밀 저울을 사용하여 폐 조직 50mg의 무게를 측정하고 분쇄 튜브에 PBS 1mL와 결합한 다음 얼음에서 철저히 분쇄합니다.
   3. 혼합물을 4°C, 3000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 표본으로 수집합니다.
   4. 농도가 다른 100μL의 시료/표준물질을 ELISA 플레이트의 각 웰에 넣고 반응 웰을 접착 밀봉 필름으로 덮은 다음 37°C 인큐베이터에서 90분 동안 배양합니다.
   5. 자동 플레이트 세척기를 사용하여 ELISA 플레이트를 4회 세척하고, 주입과 흡인 사이에 30초 간격으로 매번 350μL의 세척 버퍼를 주입합니다.
   6. 웰당 100μL의 비오틴화 항체 작업 용액을 추가하고, 접착 밀봉 필름으로 웰을 밀봉한 다음 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 절차에 따라 ELISA 플레이트를 4회 세척합니다.
   7. 웰당 100μL의 효소 접합체 작업 용액을 추가하고, 접착 밀봉 필름으로 웰을 밀봉한 다음, 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 절차에 따라 ELISA 플레이트를 4회 세척합니다.
   8. 웰당 100μL의 발색제를 첨가하고 빛으로부터 보호한 다음 37°C 인큐베이터에서 10-20분 동안 배양합니다. 그런 다음 웰당 100μL의 정지 용액을 첨가하고 철저히 혼합한 후 즉시 450nm(OD₄₅₀) 값에서 광학 밀도를 측정합니다.
      참고: 8채널 피펫을 사용하여 biotinylated antibody working solution, enzyme conjugate working solution 및 stop solution을 첨가하여 첨가를 신속하게 완료하고 잠재적인 오류를 방지할 수 있습니다.
   9. CurveExpert 소프트웨어(http:// curveexpert.webhop.net/)를 사용하여 표준 곡선을 생성하여 각 샘플 웰의 대상 물질 농도를 계산합니다.
7. 웨스턴 블로팅
   1. RIPA 용해 완충액, 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF), 인산가수분해효소 억제제를 100:1:1의 비율로 혼합하여 방사성 면역침전 분석법(RIPA) 용액을 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
   2. 액체 질소가 함유된 모르타르를 사용하여 폐 조직을 분말로 분쇄합니다.
   3. 정밀 저울을 사용하여 폐 조직 20mg의 무게를 정확하게 측정하고 이를 250μL의 RIPA 혼합 용액에 첨가합니다.
   4. 혼합물을 얼음에서 20분 동안 배양한 다음 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리하고 상등액을 샘플로 수집합니다.
   5. BCA 키트의 시약 A와 시약 B를 50:1 비율로 혼합하여 BCA 작업 용액을 준비합니다.
      1. 표준물질을 희석하여 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5mg/mL의 농도로 희석된 표준물질 용액을 제조합니다. 각 표준 용액 및 시료 20μL를 96웰 플레이트의 별도 웰에 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      2. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정합니다. 표준 용액의 농도와 흡광도를 사용하여 표준 곡선을 맞추고 샘플 농도²³을 계산합니다. RIPA 혼합 용액을 사용하여 샘플 농도를 동일한 수준으로 조정합니다.
   6. 단백질 상층액과 5x loading buffer를 4:1의 비율로 원심분리 튜브에 혼합합니다. 금속 수조에서 5분 동안 끓인 다음 12,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다.
   7. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용하여 단백질 분리를 수행하고 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인에 전기적으로 전달합니다. PVDF 멤브레인을 5% 탈지유로 RT에서 1시간 동안 막습니다.
   8. PVDF 멤브레인을 1차 항체(희석 1:1000)와 함께 4°C에서 12시간 동안 배양한 후 TBST로 각각 10분 동안 3회 세척한 다음 2차 항체(희석 1:5000)를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   9. 완전 자동 전기화학발광 면역분석 시스템을 사용하여 표적 대역을 검출하고 내장 소프트웨어를 사용하여 정량 분석을 수행합니다.
8. 통계 분석
   1. 통계 분석을 위해 적절한 소프트웨어를 활용합니다.
   2. 실험 데이터를 표준 편차± 평균으로 제시합니다.
   3. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 유의성을 확인합니다.
   4. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

결과

GSE84884의 23348개 유전자(pSS)에서 총 3290개의 DEG가 확인되었으며, 이 중 2659개의 상향 조절 유전자와 631개의 하향 조절 유전자가 포함되었습니다(그림 1A). GSE51092(pSS)의 경우, 667개의 상향 조절 유전자와 587개의 하향 조절 유전자를 포함하여 11409개의 유전자에서 총 3290개의 DEG가 확인되었습니다(그림 1B). GeneCards 데이터베이스는 102...

토론

pSS는 주로 외분비선의 침입을 특징으로 하는 질병으로 간주되지만, 분비선 외곽선의 손상은 무시할 수 없다²⁴. 폐는 pSS의 표적 기관이며, 폐 침범은 pSS의 흔한 선외 증상으로, 일반적으로 기관지 점막과 폐 간질의 림프구 침윤을 포함한다²⁵. 연구에 따르면 pSS 환자의 최소 20%가 간질성 폐질환(interstitial lung disease, ILD)을 경험한다고 합니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Color Prestained Protein Marker	Epizyme	WJ103	Western Blot
Antibody Dilution Buffer	Epizyme	PS119	Western Blot
BCA Protein Quantification Kit	Epizyme	ZJ101	Western Blot
Cytoscape 3.7.1 software	National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)	Version 3.7.1.	Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous Fluid	Epizyme	SQ203	Western Blot
Electrophoresis Buffer	Epizyme	PS105S	Western Blot
GraphPad Prism 10.0	GraphPad	Version 10.0	Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)	abclonal	AS014	Western Blot
JAK2 Antibody	Cell Signaling Technology	3230T	Western Blot
Mouse IL-1β ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0015	ELISA
Mouse IL-6 ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0006	ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF102	Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody	Cell Signaling Technology	3776S	Western Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) Antibody	Cell Signaling Technology	9145S	Western Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF101	Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)	Epizyme	PS108	Western Blot
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western Blot
R software	R Foundation for Statistical Computing	Not Applicable	Statistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation Assay	Epizyme	PC101	Western Blot
Reverse Transcription System	Promega	A3500	PCR
SDS-PAGE	Epizyme	LK303	Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)	Epizyme	LT103	Western Blot
STAT3 Antibody	Cell Signaling Technology	9139S	Western Blot
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	PCR
TBST (10×)	Epizyme	PS103	Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)	Epizyme	PS109	Western Blot
β-Actin Antibody	abclonal	AC026	Western Blot