배추속의 저산소증 내성을 연구하기 위한 양배추 Protoplast System 개발

요약

이 프로토콜은 효율적인 양배추 중엽 원형질체 시스템을 설명합니다. 다양한 산소 결핍 치료법을 테스트했으며, 이 시스템은 저산소증 반응 유전자의 높은 활성화를 보여 Brassicaceae 채소에서 범람 내성의 유전적 및 분자적 메커니즘에 대한 연구를 촉진했습니다.

초록

기후 변화로 인해 더 많은 비가 내리면서 Brassicaceae 의 주요 채소인 양배추는 홍수로 인한 저산소증 스트레스로 인해 상당한 수확량 손실에 직면해 있습니다. 양배추의 범람 내성 메커니즘을 규명하기 위해서는 양배추의 변형에 반항하는 특성을 극복하기 위해 유전적 기능 연구를 위한 다목적 플랫폼이 필요합니다. 본 연구에서는 양배추 원형질체 일시적 발현 시스템과 해당 원형체 저산소증 유도 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜은 최적화된 효소 조건을 사용하여 40%를 초과하는 transfection 효율로 양배추 잎에서 protoplast 분리의 높은 수율과 무결성을 달성했습니다. 처리 전에 잠재적인 저산소 영향을 완화하기 위해 W5 용액에 산소 가스를 버블링하여 용존 산소 수준을 높였습니다. EC-Oxyrase, OxyFluor, 아황산나트륨 및 산소 흡수 팩을 포함하여 산소 수준 조정 및 생리학적 산소 제거 처리를 위한 여러 화학 물질이 테스트되었습니다. 이중 루시페라아제 분석은 저산소증 처리 후 양배추 원형질체에서 혐기성 호흡 반응 유전자 BoADH1 및 BoSUS1L 의 프로모터가 활성화되었으며, 산소흡수제 팩으로 처리한 후 관찰된 가장 높은 유도 수준을 보여주었습니다. 요약하면, 저산소증 치료와 결합된 양배추 원시체 일시적 발현 시스템은 효율적이고 편리한 플랫폼을 보여줍니다. 이 플랫폼은 양배추의 저산소증 반응과 관련된 유전자 기능 및 분자 메커니즘에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다.

서문

지구 기후 변화는 홍수를 악화시켰고, 이는 전 세계적으로 점점 더 중요한 문제로 부상하고 있습니다. 최근 수십 년 동안 홍수 발생 빈도가 증가하는 추세를 보였으며, 그 결과 상당한 농작물 손실이 발생했다 ^1,2. 전 세계적으로 중요한 채소인 양배추(Brassica oleracea var. capitata L.)는 폭우의 악영향에 취약하기 때문에 극심한 기상 이변에 직면하여 지속 가능한 생산을 보장하기 위해 홍수에 강한 양배추 품종을 개발해야 합니다. 따라서 양배추의 범람 스트레스와 관련된 분자 메커니즘을 이해하는 것이 이 문제를 해결하는 데 필수적입니다.

수중 조건에서 식물의 유전자 조절 메커니즘을 이해하기 위해 형질전환 계통은 유전 기능 연구에 널리 사용됩니다. 그러나 이 접근 방식은 높은 비용, 시간이 많이 소요되는 변형 및 하위 배양 프로세스뿐만 아니라 많은 작물 종의 낮은 변형 효율로 인해 제약을 받기 때문에 대체 방법론의 개발이 필요합니다. Protoplast 기반 일시적 발현 시스템은 다재다능하고 효율적인 대안으로 식물 분자 연구에 널리 적용되어 왔습니다. 이러한 시스템은 프로모터 활성, 환경 신호에 대한 반응 신호 경로, 단백질-단백질 또는 단백질-DNA 상호 작용 및 세포 내 국소화에 대한 조사를 용이하게 합니다³. 원형질체 일시적 발현 시스템의 확립은 모델 식물^4,5 뿐만 아니라 사탕수수⁶, 카네이션⁷, 호접란 ^{난초 8} 및 가지⁹와 같은 경제적으로 중요한 작물에서도 보고되었습니다. 또한 이러한 시스템은 Camellia oleifera¹⁰및 Populus trichocarpa¹¹을 포함한 목본 식물에서 성공적으로 구현되었습니다. 그러나 침수로 인한 저산소증 스트레스 하에서 잎이 많은 채소를 연구하기 위해 원형질체 시스템을 적용하기 위한 프로토콜은 제한적입니다. 따라서 양배추 원형질체 일시적 발현 시스템을 사용하여 잎이 많은 채소의 저산소증 반응을 연구하는 데 관심이 있는 사람들을 위해 이 작업에서 통합 프로토콜이 개발되었습니다.

세포 수준에서 침수 유도 저산소증 반응을 수행하기 위해 이전 연구에서 저산소 환경을 시뮬레이션하기 위해 여러 산소 제거 방법론이 사용되었습니다. 여기에는 EC-Oxyrase, OxyFluor, 아황산나트륨 및 산소 소비 백의 사용이 포함됩니다. EC-Oxyrase는 일반적으로 인간 세포주¹² 및 애기장대 원형체¹³에서 혐기성 치료에 사용됩니다. OxyFluor는 생세포 형광 이미징 중 활성 산소 종으로 인한 광표백을 완화하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌습니다^14,15. 아황산나트륨(sodium sulfite)은 선충의 혐기성 처리에 사용되어 왔으며¹⁶ 최근에는 염색질 면역침전(ChIP) 분석법과 같은 기술과 함께 쌀 원형질체에 사용되었습니다¹⁷. 주로 혐기성 박테리아 배양에 사용되는 산소 흡수제 팩¹⁸은 또한 혐기성 조건¹⁹에서 옥수수 원형질체에서 ZmPORB1 프로모터의 활성화를 유도하는 효능을 입증했습니다.

현재 연구는 양배추 원형질체 분리 및 일시적 발현을 위한 강력한 파이프라인을 구축하는 것을 목표로 합니다. 그 후, dual-luciferase assay를 사용하여 혐기성 반응 유전자의 promoter 활성을 평가하여 다양한 산소 조절 처리의 효능을 평가했습니다. 본 연구에서 개발된 프로토콜은 브라시카 시스템의 침수 또는 저산소증 스트레스와 관련된 향후 연구에 유용할 것으로 기대된다.

프로토콜

이 연구에서는 두 가지 상업용 양배추(B. oleracea var. capitata) 품종인 'Fuyudori'와 '228'이 활용되었습니다. 프로토콜 워크플로우의 그래픽 표현은 그림 1에 나와 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 양배추 묘목의 준비

1. 상업용 식물 기질을 사용하여 '후유도리'와 '228' 양배추 씨앗을 48웰 플러그 트레이(L 49cm x W 28cm x H 5cm)의 둥근 사각형 모양(D 4.5cm x H 4.5cm)에 파종합니다. 씨앗을 성장 매체에 약 1cm 깊이로 삽입합니다.
2. 22 ° C의 성장실에서 16/8 시간의 명암 주기로 양배추 묘목을 재배합니다. 광기 동안 100μmol ^m-2·^s-1 (백색 형광등)의 광도를 유지합니다.
3. 2-3 주 동안 자란 후, 추가 중엽 원형질체 분리를 위해 2 잎 단계에서 양배추 묘목을 사용하십시오.
   참고: 양배추 묘목의 권장 크기는 2잎 단계로, 두 번째 잎은 완전히 확장되지만 세 번째 잎은 확장되지 않고 길이가 1cm보다 짧습니다(그림 2A). 양배추 묘목의 발달 단계를 동기화하기 위해 'Fuyudori' 씨앗은 성장 속도가 다르기 때문에 '228' 씨앗보다 약 2일 일찍 파종해야 합니다. 이 조정은 원하는 단계에서 양배추 식물의 균일한 성장과 성숙을 보장합니다.

2. 양배추 원형질체는 격리합니다.

1. 각 프로토플라스트를 분리하기 전에 12.5mL의 효소 용액(표 1)을 준비합니다.
   1. 10mM MES(pH 5.7)와 0.6M의 만니톨로 용액을 55°C에서 예열합니다. 1.5% 셀룰라아제 R10 및 0.75% 마케로자임 R10을 첨가한 후 55°C에서 10분 동안 용액을 계속 예열합니다.
   2. 효소 용액이 실온(25°C)으로 냉각된 후 10mM의 CaCl₂ 와 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가합니다. 필터는 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 준비된 효소 용액을 9cm 페트리 접시에 살균합니다.
      참고: 용액을 미리 데우면 효소 용해도가 증가하고 프로테아제가 비활성화됩니다. 소화 효과는 셀룰라아제 효소의 종류에 따라 다릅니다. 셀룰라아제 R10과 마케로자임 R10의 조합은 양배추 원형질체 분리에 적합합니다.
2. 5-8 개의 양배추 묘목에서 새로 팽창 한 두 번째 진엽을 모아 날카로운 면도날을 사용하여 0.5-1.0mm 스트립으로 자릅니다. 잎 조각을 즉시 갓 준비한 효소 용액에 옮깁니다.
   참고: 적절한 단계에서 양배추에서 건강하고 지정된 잎을 선택하는 것이 중요합니다. 2잎 단계에서 양배추 묘목에서 새로 확장된 두 번째 진잎은 가장 높은 원형질체 분리 효율을 제공합니다. 과도하게 성숙한 식물, 자엽 또는 노화된 잎은 원형질체 분리에 권장되지 않습니다. 5-12개의 잘 팽창된 진잎은 12.5mL의 효소 용액에서 양배추 원형질체를 성공적으로 생산할 수 있습니다. 원형질체 분리에 필요한 잎의 수는 필요한 원형질체의 원하는 양에 따라 다릅니다. 일반적으로 5-8개의 잎에서 얻은 원형질체는 후속 실험 절차에 충분합니다.
3. 어둠 속에서 30분 동안 진공 침투한 후(그림 2B), 양배추 잎 조각을 효소 용액(그림 2C)에 담근 후 실온에서 4-16시간 동안 더 보관합니다.
   참고: 효소 소화 시간은 양배추 품종에 따라 다를 수 있으며 특정 유전자형에 따라 최적화해야 합니다. 예를 들어, '후유도리'는 '후유도리'의 잎이 두껍기 때문에 '228'(4시간)에 비해 더 긴 소화 시간(16시간)이 필요합니다.
4. 프로토플라스트 함유 용액을 2mM의 MES(pH 5.7), 154mM의 NaCl, 125mM의 CaCl_2, 5mM의 KCl 및 5mM의 포도당으로 구성된 동일한 부피의 W5 용액으로 희석하여 효소 분해를 중지합니다(준비는 표 1 참조).
5. 부드럽게 소용돌이치거나 오비탈 쉐이커를 사용하여 프로토플라스트 현탁액을 해제합니다. 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 코니컬 튜브로 여과합니다.
   참고: 분리된 프로토플라스트는 70μm 세포 여과기를 통과할 수 있으며, 소화되지 않은 식물 파편은 여과기에 의해 유지된 후 현탁액에서 제거됩니다. 셀 스트레이너는 세척 후 75% 에탄올로 재사용할 수 있지만 사용하기 전에 잔류 에탄올을 제거하기 위해 W5 용액으로 셀 스트레이너를 완전히 헹굴 필요가 있습니다.
6. 프로톱플라스트 용액을 150 x g 로 4°C에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 원뿔형 튜브의 벽을 따라 10mL의 W5 용액을 1mL·^s-1의 대략적인 유속으로 첨가하여 펠릿화된 원형질체를 부드럽게 세척합니다. 150 x g 의 튜브를 4°C에서 2분 동안 원심분리하고 이 세척 절차를 다시 반복하여 효소 용액이 완전히 제거되도록 합니다.
7. 프로토플라스트를 W5 용액에 다시 현탁시키고 30분 동안 얼음 위에 놓습니다. 얼음 배양 후 모든 상층액이 제거될 때까지 한 번에 1mL씩 피펫으로 상층액을 제거합니다.
8. 4mM의 MES(pH 5.7), 0.4M의 만니톨 및 15mM의 MgCl₂ 로 구성된 얼음 예냉 MMG 용액에 프로톱플라스트를 재현탁시킵니다(준비는 표 1 참조).
9. 혈구계로 프로토플라체 농도를 측정하고 MMG 용액을 사용하여 최종 농도를 4 x 10⁵ 프로토플라스트·^mL-1 로 조정합니다.

3. Protoplasts 형질주입

1. 총 부피 10μL의 플라스미드(5-10μg)(보충 파일 1)와 100μL의 프로토플라스트(4 x 10,⁴ 개의 프로토플라스트)를 혼합하고 얼음에 10분 동안 놓습니다.
   참고: transfection grade plasmid 정제의 경우, 제조업체의 지침에 따라 시판되는 plasmid kit가 사용됩니다. 대략 4 x 10⁴ protoplasts는 일반적으로 dual-luciferase reporter assay에 사용됩니다. 대규모 실험의 경우 더 많은 양의 protoplast를 transfection에 사용할 수 있습니다. 구체적으로, 10μg의 플라스미드로 transfection된 약 2 x 10⁵ protoplasts는 30%에서 40%에 이르는 입증된 transfection 효율을 나타냅니다.
2. 40% 폴리에틸렌 글리콜 4000(PEG4000), 0.1M의 CaCl₂ 및 0.2M의 만니톨을 함유하는 동일한 부피(110μL)의 갓 제조된 PEG 용액(준비는 표 1 참조)을 프로토플라스트 용액에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
3. 프로토플라스트 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양한 다음 440μL의 W5 용액을 첨가하여 반응을 종료합니다.
4. 형질주입된 프로토플라스트를 150 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하고 펠릿을 산소가 풍부한 W5 용액 750μL에 재현탁합니다. 재현탁된 프로토플라스트를 1% BSA가 사전 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
   알림: 세포 배양에 사용되는 W5 용액은 에어 스톤에 연결된 산소 발생기(~90% 산소)를 사용하여 5분 동안 산소로 거품을 일으켜야 합니다(그림 2D). 이 산소화 과정에 따라 W5 용액의 최종 용존 산소 농도는 7.84mg· ^L-1 ± 0.05 mg· ^L-1 내지 29.18 mg· ^L-1 ± 0.43 mg· ^L-1, 용존 산소 측정기로 측정한 결과. 형질주입된 원형질세포의 재현탁을 위한 W5 용액의 부피는 사용되는 조직 세포 배양 플레이트의 유형에 따라 다릅니다. 12웰 또는 24웰 세포 배양 플레이트의 경우, 웰 내부의 깊이가 더 깊기 때문에 배양 중 저산소증 스트레스를 완화하기 위해 W5 용액의 부피를 줄이는 것이 좋습니다. BSA 코팅을 위해 배양 플레이트의 각 웰에 1mL의 1% BSA 용액을 투여하여 10초 동안 웰을 코팅할 수 있었습니다. 그런 다음 BSA 용액을 각 웰에서 폐기하고 웰을 W5 용액으로 다시 채웠습니다. 이 절차는 BSA를 사용하여 일시적인 비접착성 표면을 만드는 것을 목표로 하여 후속 실험 단계에서 프로토플라스트가 배양판의 플라스틱 표면에 달라붙는 것을 효과적으로 방지하는 것을 목표로 했습니다.

4. 양배추 protoplasts에 저산소증 처리

1. protoplast transfection 직후 화학적 또는 물리적으로 유도된 저산소증 치료를 실시합니다.
   참고: 저산소증 치료는 프로토플라체 형질주입 직후에 적용하는 것이 좋습니다. 원형아체의 장기간 배양은 후속 저산소증 반응을 감소시킬 수 있습니다.
   1. 양배추 원형질체에 화학적으로 유도된 저산소증의 경우 W5 원형질체 용액에 OxyFluor, EC-Oxyrase 및 아황산나트륨을 첨가합니다.
      참고: W5에서 0.6 units·^mL-1 EC-oxyrase, 0.6 units·^mL-1 OxyFluor 및 1 g·^mL-1 sodium sulfite를 사용하여 조사된 두 양배추 품종에서 원형질체 무결성에 대한 손상이 적은 BoADH1 및 BoSUS1L 프로모터(그림 3A)를 유도할 수 있는 테스트 조건이었습니다.
   2. 산소를 소비하는 백으로 인한 저산소증의 경우 3.5L 혐기성 병에 두 개의 산소 흡수 팩을 넣어 저산소 환경을 조성합니다.
2. 저산소증 처리된 프로토플라스트를 150 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 수확합니다. 수집된 원형질체를 액체 질소를 사용하여 동결하고 후속 분석을 위해 -80°C 냉동고에 보관합니다.

5. 이중 루시페라제 분석

1. 제조업체의 지침에 따라 약간의 수정을 가하여 이중 루시퍼라제 리포터 분석을 수행합니다.
   1. 양배추 프로토플라스트를 50μL의 1x 수동 용해 완충액과 와류에서 10초 동안 재현탁합니다.
   2. 파괴된 프로토플라스트를 얼음에서 10분 동안 배양하고 4°C에서 10분 동안 10,000 x g 에서 원심분리 후 상층액을 수집합니다.
   3. 20μL의 세포 용해물을 마이크로플레이트의 각 웰에 추가합니다. 100μL의 Luciferase 분석 시약 II를 웰에 분배하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정합니다.
   4. 시중에서 판매되는 분석 시약 100μL를 각 웰에 추가하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 Renilla 루시퍼라제 활성을 측정합니다.

결과

이 연구는 양배추 원형질체를 활용하는 일시적 발현 시스템을 성공적으로 개발했습니다(워크플로우는 그림 1 참조). 프로토플라스트는 셀룰라아제/마케로자임 소화 및 암진공 침투를 사용하여 상업용 양배추 품종 'Fuyudori' 및 '228'의 적절한 크기(그림 2A)인 2주에서 3주 된 양배추 잎에서 분리했습니다(그림 2B

토론

이 프로토콜은 두 가지 상업용 양배추 품종에서 원형질체를 분리하기 위한 간소화된 방법을 제시합니다. 이 방법의 효능은 주로 두 가지 중요한 품질 관리 파라미터, 즉 생존 가능한 프로토플라스트의 수율과 프로토플라스트 트랜스펙션의 효율성을 통해 평가됩니다. 이 프로토콜을 구현하면 4.00 x 10⁶ protoplasts·g⁻¹· 두 양배추 품종의 중엽 조직의 FW(

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation