열 스트레스 하에서 폴리좀 프로파일을 사용한 translation efficiency test

요약

여기에 제시된 프로토콜은 리보솜과 관련된 mRNA인 translatome을 자당 밀도 구배 원심분리 를 통해 애기장대 에서 비폴리솜 및 폴리솜 RNA로 분리하기 위한 폴리솜 프로파일링을 포함합니다. 이 방법은 열 스트레스 애기장대(heat-stressed Arabidopsis)의 번역 효율성을 보여줍니다.

초록

열 스트레스 하에서 서로 다른 유전자의 번역 제어는 식물이 환경에 적응하는 데 중요한 단계입니다. 다양한 유전자의 번역 활동을 평가하면 식물 회복력의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 지구 기후 변화에 직면하여 스트레스 내성이 향상된 작물 개발에 기여할 수 있습니다. 이 논문은 열 스트레스에 노출된 식물에서 폴리좀 프로파일링을 통해 translation efficiency를 평가하는 자세한 방법론을 제시합니다. 절차는 애기장대에 대한 열 스트레스 처리, 폴리좀 프로파일을 사용한 translation efficiency test, profile을 기반으로 non-polysomal 및 polysomal RNA를 분리하여 translation efficiency 계산의 세 부분으로 나뉩니다. 첫 번째 부분에서, 애기장대(Arabidopsis) 식물은 환경 문제를 모방하기 위해 제어된 열 스트레스 조건에 노출됩니다. 이 처리에는 지정된 기간 동안 식물을 고온에 노출시켜 일관되고 재현 가능한 응력 유도를 보장하는 것이 포함됩니다. 이 단계는 열 스트레스에 대한 식물의 생리학적 및 분자적 반응을 연구하는 데 중요합니다. 두 번째 부분은 폴리솜 프로파일링을 사용한 번역 효율성 테스트입니다. 폴리좀은 리보솜 로딩을 기반으로 mRNA를 분리하는 자당 구배 원심분리를 통해 추출됩니다. 이를 통해 mRNA의 리보솜 점유를 검사할 수 있으며, 스트레스 조건에서 번역 제어 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 세 번째 부분에서, RNA는 폴리솜 및 비폴리솜 분획 모두에서 분리됩니다. Spike-in RNA는 각 분획에서 RNA의 양을 정확하게 측정하는 데 사용됩니다. translation efficiency의 계산은 정상 및 열 스트레스 조건에서 이러한 분획에 걸친 mRNA의 분포를 비교하여 수행됩니다. 특정 유전자의 번역 활성은 리보솜 관련 RNA 및 총 RNA로 정량적 Real-Time PCR(qRT-PCR)을 수행하여 추가로 평가됩니다. 이 방법론은 열 스트레스의 영향에만 전적으로 초점을 맞추며, 식물의 병진 조절을 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

번역은 유기체가 mRNA에서 기능성 단백질을 합성하여 필수 세포 기능과 신진대사 및 신호 전달과 같은 생물학적 과정을 지원하고 스트레스 반응을 가능하게 하는 데 매우 중요합니다. 번역이 없으면 세포는 중요한 단백질을 생산할 수 없어 세포의 구조, 기능 및 조절에 영향을 미쳐 생명 유지에 영향을 미치고 생물 다양성을 육성합니다 ^1,2. 따라서 식물의 번역 효율성을 연구하는 것이 중요합니다. 번역에는 몇 가지 필수 단계가 포함됩니다. 첫째, 개시는 mRNA가 리보솜에 결합할 때 발생하며, 진핵생물의 eIF와 같은 개시 인자에 의해 촉진되며, 이는 일반적으로 AUG의 시작 코돈을 식별합니다. 다음으로, 각각 특정 아미노산을 운반하는 전달 RNA(tRNA) 분자가 리보솜에 순차적으로 결합하면서 신장이 진행됩니다. 펩타이드 결합은 인접한 아미노산 사이에 형성되어 mRNA 염기서열에 따라 폴리펩티드 사슬을 연장합니다. 마지막으로, 종결은 리보솜이 새로 합성된 단백질을 방출하도록 유도하는 방출 인자에 의해 인식되는 정지 코돈(UAA, UAG 또는 UGA)을 만나면 시작됩니다. 번역 전반에 걸쳐 다양한 진핵생물 시작 인자(eIF), 신장 인자....

프로토콜

1. 열 스트레스 처리된 애기장대(Arabidopsis) 묘목 시료 전처리

1. 각 복제 및 각 조건에 대해 250 개의 씨앗을 접시에 담고, 여과지에 스포이드를 사용하여 Murashige 및 Skoog (MS) 기저 매체 한천 플레이트에 자당 (pH 5.6)을 첨가하고 1.2 % 식물류가를 보충합니다.
   알림: MS 플레이트에 묘목을 심으려면 멸균 여과지를 플레이트에 올려 묘목 뿌리가 매체 깊숙이 침투하는 것을 방지하여 샘플링을 용이하게 합니다. 그런 다음 여과지 위에 씨앗을 심습니다. 식물 성장 및 실험 결과에 대한 설탕의 영향을 배제하기 위해, 재배를 위해 자당을 포함하지 않는 MS 배지를 사용하는 것이 권장됩니다.
2. 심은 씨앗이 들어있는 MS 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 4 °C에서 2 일 동안 배양하여 vernalization을 유도합니다.
3. vernalized 종자를 100 μmol/m²/s의 광강도로 22 °C에서 16 h: 8 h, light-dark photoperiod 아래에서 성장하기 위해 성장 챔버로 옮깁니다.
....

토론

이 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis) 묘목의 번역 효율성을 측정하기 위한 간단하고 표준화된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 2차 원심분리 및 RNA 추출 시약 추출을 통해 RNA 안정성을 보장하고 자당 그래디언트의 세심한 준비를 하는 것입니다. 또한, spike-in normalization method를 사용하여 non-polysomal 및 polysomal RNA를 정규화하고 정량화하기 위한 중요한 단계를 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile