화학유전학 프로파일링 데이터에서 사망 조절 유전자를 식별하기 위한 MEDUSA

요약

이 프로토콜은 MEDUSA 분석법을 사용하여 각 유전자 knockout의 사멸 조절 효과를 정량화하는 방법을 설명합니다. 여기에는 감도를 최적화하는 실험 조건을 결정하는 방법에 대한 지침과 분석 수행에 대한 단계별 자습서가 포함되어 있습니다.

초록

기능 향상 또는 상실 유전적 섭동에 대한 체계적인 스크리닝은 본질적으로 관심 있는 모든 세포 과정에 대한 유전적 의존성 및 조절 메커니즘을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 실험에는 일반적으로 단일 유전자 섭동 풀에서 프로파일링하고 각 유전적 섭동이 상대적인 세포 적합성에 미치는 영향을 포함합니다. 종종 화학-유전학 프로파일링이라고 하는 약물 효능 연구의 맥락에서 적용할 때, 이러한 방법은 약물 작용 메커니즘을 식별하는 데 효과적이어야 합니다. 불행히도 적합성 기반 화학-유전자 프로파일링 연구는 약물 반응의 모든 구성 요소를 식별하는 데 효과적이지 않습니다. 예를 들어, 이러한 연구는 일반적으로 어떤 유전자가 약물에 의한 세포 사멸을 조절하는지 확인하지 못합니다. 건강 기반 검사에서 죽음 조절을 모호하게 만드는 데는 증식 속도 변화의 혼란스러운 영향, 성장과 죽음 사이의 약물 유도 조정의 변화, 그리고 경우에 따라 살아있는 세포와 죽은 세포에서 DNA를 분리할 수 없는 것 등 몇 가지 문제가 있습니다. MEDUSA는 기존 화학유전자 프로파일링 데이터에서 죽음 조절 유전자를 식별하기 위한 분석 방법입니다. 이는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 피트니스 자체에 점수를 매기는 대신 관찰된 피트니스 프로파일을 생성한 성장 및 사망률을 추정하는 방식으로 작동합니다. 이 방법의 효과적인 사용은 약물 투여량, 시작 집단 크기 및 분석 길이를 포함한 실험 조건의 최적 적정에 달려 있습니다. 이 원고는 MEDUSA 기반 분석을 위한 화학-유전자 프로파일링 연구를 설정하는 방법을 설명하고, 화학-유전자 프로파일링 데이터에서 사망률을 정량화하기 위해 이 방법을 사용하는 방법을 보여줍니다.

서문

화학-유전자 프로파일링에서는 주어진 약물 반응에 대한 각 유전자의 기여도를 이해하기 위해 체계적인 유전적 섭동이 사용됩니다 ^1,2,3. 이러한 실험은 가치가 있으며 약물의 결합 표적 및 약물 유입/유출 메커니즘을 포함하여 약물 반응에 대한 중요한 통찰력을 밝힐 수 있습니다. 그러나 이러한 실험은 일반적으로 모든 유전자를 동시에 평가하는 풀링 방식으로 수행되기 때문에 화학 유전학 프로파일링 데이터에서 기계론적 통찰력을 생성하는 것은 어려울 수 있습니다.

약물 유도 세포 사멸에 대한 제어 메커니즘 및 유전적 의존성은 화학 유전학 프로파일링 데이터에서 해결하기 어려운 경향이 있습니다. 이 문제에는 여러 가지 이유가 있지만, 그 중 많은 원인은 세포 증식⁴의 변이의 영향에서 비롯됩니다. 예를 들어, 세포는 기하급수적으로 증식하기 때문에 증식 속도에 대한 유전적 섭동의 영향은 세포 사멸률의 변화보다 개체군 크기에 더 큰 영향을 미칩니다. 또한, 이러한 편향된 민감도는 시간이 지남에 따라 악화되고 이러한 실험은 일반적으로 몇 주에 걸쳐 수행되기 때문에 대부분의 연구는 증식 결함에 매우 민감하고 약물 유도 세포 사멸의 변화에 본질적으로 둔감하도록 최적화되어 있습니다. 다른 증식과 관련된 문제로는 증식과 사멸 사이의 다양한 조정(예: 죽어가는 동안 각 클론이 얼마나 빨리 성장하는지, 그리고 이것이 유전적 섭동에 따라 다른가) 및 약물이 없을 때 각 클론에 대한 증식 속도의 변화(약물이 효과적이지 않은 경우 회수되어야 하거나 회복될 수 있었던 세포의 예상 수가 변경됨)가 있습니다. 결론은 화학-유전학 프로파일링 실험은 일반적으로 상대적인 집단 크기에 비례하는 측정을 사용하여 치료된 집단과 치료되지 않은 집단을 비교하여 유전적 섭동의 영향을 점수화한다는 것입니다. 개체군 크기는 세포 성장과 세포 사멸률의 산물이기 때문에 세포 사멸의 관점에서 볼 때 증식은 혼란스러운 영향을 미칩니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 MEDUSA(Simulation-assisted ^Approach)5를 사용하여 사망을 평가하는 방법을 만들었습니다. MEDUSA는 컴퓨터 시뮬레이션의 렌즈를 통해 관찰된 상대 개체군 크기 데이터를 해석하여 각 유전자 클론에 대해 관찰된 약물 반응을 생성한 약물 유발 성장률과 사망률의 조합을 추론하는 방식으로 작동합니다. 이전 데이터는 이 방법이 유전적 섭동이 약물 유도 사망률에 어떻게 영향을 미치는지 정확하게 추론할 수 있음을 시사하지만, 이 방법의 정확도는 세포 증식과 세포 사멸이 약물에 의해 어떻게 조정되고 이러한 비율이 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지에 대한 자세한 이해에 달려 있습니다 ^5,6. 또한 MEDUSA 기반 추론은 상당한 세포 사멸을 유발하는 용량으로 약물을 테스트해야 합니다. 중요한 것은 이러한 약물 투여 조건으로 인해 시작 개체군 크기와 분석 길이에 대한 추가적인 우려가 발생하며, 이를 신중하게 고려하고 최적화해야 한다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 MEDUSA 기반 분석을 위한 화학-유전자 프로파일링 연구를 설정하는 방법을 설명하고 이 분석 방법의 자세한 사용을 제공합니다. MEDUSA의 전반적인 목표는 각 유전자 결실이 약물 유도 성장 및 사망률에 어떤 영향을 미치는지 확인하는 것입니다.

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프로토콜

1. 세포 사멸을 유도하기 위한 약물 투여량의 최적화

참고: 아래 프로토콜은 FLICK 분석 ^7,8을 사용하여 세포주, 약물 및 용량의 한 가지 조합을 최적화하기 위한 것입니다. 이 프로토콜의 예시 데이터는 U2OS 세포에서 5μM 에토포사이드의 최적화 및 스크리닝을 설명하지만, 세포주 및 약물/용량의 다른 원하는 조합에도 동일한 최적화 단계를 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 수집 또는 분석을 필요로 하지 않습니다. 이 프로토콜은 죽은 세포가 제거된 경우 현탁 배양에 사용할 수 있습니다. 현탁 배양의 경우, 생존력 마커 또는 세포 사멸에 특이적인 마커를 사용하여 죽은 세포를 분류/분리할 수 있습니다.

1. FLICK 분석을 수행하기 전에⁸에 설명된 자세한 프로토콜을 사용하여 세포 수, Triton-X 투과성, SYTOX 농도 및 플레이트 리더 획득 설정을 최적화합니다.
2. 검은색 투명 바닥 96웰 플레이트의 플레이트 셀. 일반적인 파종 밀도는 웰당 1500-5000개의 세포이며, 이 수치는 세포주당 최적화되어야 합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 및 습도 16-24 시간 동안 세포를 배양합니다.
3. 단계 (1.1)에서 최적으로 확인된 SYTOX 농도를 포함하는 배지에서 약물 희석액을 준비합니다. 약물은 일반적으로 생물학적 또는 임상적으로 관련된 8-12 용량을 포함하는 로그 희석 시리즈에 걸쳐 테스트됩니다.
   참고: 특정 약물은 SYTOX와 동일한 파장에서 형광을 방출할 수 있으므로 이 분석으로 정량화하는 것이 불가능합니다. 이러한 경우 다른 파장에서 형광을 방출하는 SYTOX 변형을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 또한 이 분석법은 SYTOX 형광에 영향을 미치거나 SYTOX가 DNA에 결합하는 것을 방해하는 약물에 대한 반응을 평가할 수 없습니다.
4. (1.1)단계에서 최적화된 농도로 Triton-X를 사용하여 하나의 플레이트(T0)를 용해합니다. 세포 용해 후 플레이트 리더를 사용하여 SYTOX 형광을 측정하고 형광과 세포 수 사이의 경험적으로 확립된 관계를 기반으로 총 시작 세포 수를 측정합니다(FLICK 프로토콜 ^7,8 참조).
5. 플레이트 리더를 사용하여 T0에서 실험 플레이트의 SYTOX 형광을 측정하고 단계 (1.1)에서 설정을 최적화합니다.
6. 3일 동안 시간 경과에 따른 SYTOX 신호를 모니터링합니다. 결과로 생성되는 kinetic 데이터를 제한하려면 하루에 각각 4시간 간격으로 3개 이상의 시점을 사용하십시오.
   참고: 이 프로토콜은 3일 동안 세포 사멸 및 성장을 평가합니다. 이 기간은 일반적으로 죽음을 유발하는 약물에 충분합니다. 그러나 분석은 대체 사멸 역학을 가진 약물을 수용하기 위해 단축 또는 연장될 수 있습니다.
7. 최종 시점 이후, Triton-X로 실험 플레이트를 용해하여 각 조건의 최종 개체군 크기를 결정합니다.
8. FLICK 프로토콜 ^7,8에 설명된 대로 FV(Fractional Viability)를 계산하고 종말점 데이터를 투여 곡선에 맞춥니다.
9. FV 용량 곡선을 평가하여 약 50%의 세포 사멸을 유도하는 약물 용량을 식별합니다.
   참고: SYTOX에 의한 사멸 세포의 식별은 원형질막 파열과 핵막 파괴를 모두 필요로 합니다. 이러한 세포막은 지속적인 유지가 필요하므로 SYTOX는 약물에 의해 유도된 세포 사멸 메커니즘에 관계없이 죽은 세포를 식별합니다. 그러나 이러한 과정은 모든 형태의 세포 사멸에 대해 동일한 효과로 발생하지 않으며, 이는 죽은 세포를 정확하게 측정하는 SYTOX의 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 서로 다른 세포 사멸 메커니즘은 다양한 안정성의 세포 시체를 생성합니다. 그러나 우리는 지금까지 테스트된 모든 형태의 세포 사멸이 SYTOX 결합 DNA(투과화된 핵 내부 또는 세포 배양 배지)를 초래한다는 것을 발견했습니다. 이 SYTOX 신호는 일반적으로 72시간 분석 전반에 걸쳐 안정적이지만 분석의 시작과 끝에서 총 세포 수를 평가하여 모니터링할 수 있습니다.

2. 분석 길이 선택

1. 1단계에서 수집된 FLICK 데이터를 사용하여 FLICK 프로토콜 ^7,8에 설명된 대로 시간 경과에 따른 각 조건의 치사 분율(LF)을 계산합니다. 앞서 설명한 바와 같이 kinetic LF 데이터를 시차 지수 죽음(LED) 모델에 피팅합니다⁹.
2. 1단계에서 식별된 각 치사량에 대한 시간 경과에 따른 LF를 플로팅합니다. ~50% LF를 생성하는 용량과 시점을 선택하십시오.
   참고: ~50%의 치사율은 CRISPR 스크리닝 데이터에서 강력한 죽음 특이적 신호를 풍부하게 하는 동시에 라이브러리 표현을 유지하기에 충분한 살아있는 세포를 남깁니다⁵. 그러나 일부 약물은 문헌 우선 순위 또는 특정 원하는 표현형을 유도하는 좁은 용량 범위에 의해 제한됩니다. 용량이 제한되는 경우 원하는 용량이 ~50% LF에 도달하도록 분석 종점을 줄이거나 확장해야 합니다. 50%의 치사율이 불가능하다면 시작 개체군의 크기를 늘려야 할 수도 있습니다.

3. 시작 모집단 크기 결정

1. 위의 최적화를 기반으로 스크리닝을 더욱 최적화하기 위해 원하는 약물 용량을 선택하십시오.
2. 완전한 매체의 10cm 접시에 있는 플레이트 셀. 각 조건은 T = 0 시점을 포함하여 스크린 길이 동안 12-24시간마다 세포를 계수할 수 있도록 기술적 삼중주와 충분한 생물학적 복제로 도금되어야 합니다.
   참고: 도금된 세포 수는 순 집단 성장률과 세포 크기를 고려하여 처리되지 않은 세포와 처리된 세포에 대해 별도로 최적화해야 할 수 있습니다. 세포는 일반적으로 분석 종말점에서 세포 건강을 손상시키지 않는 밀도(즉, 많은 세포 유형의 경우 80% < 융합)를 초래하는 밀도로 도말해야 합니다. 처리된 세포와 처리되지 않은 세포는 라이브러리 표현이 유지되는 한 필요한 경우 스크리닝 중에 재도금할 수도 있습니다.
3. 37°C에서 5% CO₂로 밤새 세포를 배양합니다.
4. 원하는 농도의 약물을 치료 플레이트에 첨가합니다. 동시에 처리되지 않은 3개의 플레이트에서 세포를 채취하고 혈구계를 사용하여 살아있는 세포의 수를 계산합니다. 죽은 세포를 트리판 블루(또는 이에 상응하는 생존율 염료)로 염색하여 살아있는 세포만 계수되도록 합니다. 이러한 데이터는 T = 0 시점에서의 셀 수를 설정합니다.
5. 12-24시간 후 3개의 처리되지 않은 플레이트와 3개의 처리된 플레이트에서 세포를 수확하고 살아있는 세포의 수를 계산합니다. 분석 종말점에 도달할 때까지 수확을 반복합니다. 약물 및 세포 사멸 역학을 완전히 이해하려면 (2.2)단계에서 식별된 시점 이후 24-48시간 동안 살아있는 세포를 모니터링하는 것이 좋습니다.
6. 시간(x축)에 따른 모집단 크기(y축)를 플로팅하여 생존 가능성의 변화를 시각화합니다.
   참고: 관찰된 최대 세포 수와 최종 집단 크기를 기반으로 종말점에서 치사율을 대략적으로 추정할 수 있습니다. 이는 FLICK 분석(단계 1.9 및 단계 2.2)을 사용하여 생성된 분획 생존율 및 치사 분획 데이터와 비교하여 예상되는 세포 사멸량을 달성해야 합니다.
7. 모집단 크기가 가장 작은 시점을 식별합니다. 약물의 존재 상태에서 발생하는 성장량에 따라 이는 CRISPR 스크리닝의 시작 또는 끝에 있게 됩니다.
8. 시작 모집단 크기를 선택합니다. 화면 전체에서 최소 500x-1000x 라이브러리 적용 범위를 유지하도록 시작 셀 수가 최적화되어 있는지 확인합니다.
   참고: 예를 들어, TKOv3 라이브러리에는 70,948개의 sgRNA가 있습니다. 이 라이브러리를 500x coverage로 나타내려면 분석 전반에 걸쳐 조건당 복제당 35,474,000개 이상의 세포를 유지해야 합니다. 이러한 병목 현상 집단 크기는 분석 시작 시 또는 트리프신화 및 다운샘플링 후에 처리되지 않거나 증식하는 상태에 대한 경우가 많습니다. 대조적으로, 병목 현상 개체군 크기는 상당한 치사율을 유발하는 약물 치료에 대한 분석 종말점의 개체군 크기에 의해 결정되는 경우가 많습니다.
9. 원하는 경우 CRISPR 스크리닝에 사용할 플레이트(예: 15cm 플레이트)에서 위의 최적화를 반복하여 약물 효능이 올바르게 확장되는지 확인합니다.

4. CRISPR 스크리닝 수행

참고: 약물 투여 및 분석 길이를 최적화한 후 확립된 CRISPR 스크리닝 방법을 사용하여 세포를 스크리닝할 수 있습니다. Moffat lab^10,11의 TKO 스크리닝 프로토콜과 같은 확립된 프로토콜은 CRISPR 스크리닝 라이브러리를 준비하고, 바이러스를 생성하고, CRISPR 스크리닝을 수행하고, 염기서열분석을 위한 라이브러리를 준비하는 데 사용할 수 있습니다(그림 1A-B). 아래 프로토콜은 염기서열분석 후 카운트 수준 데이터에 대해 수행해야 하는 MEDUSA 분석과 관련된 단계를 설명합니다.

1. 아래와 같이 각 sgRNA에 대해 실험적으로 관찰된 fold 변화를 계산합니다(그림 1C).
   1. sgRNA 수준 카운트 테이블을 생성하여 분석을 위한 염기서열분석 데이터를 준비합니다. Trim and map sequencing libraries using standard pipelines(표준 파이프라인을 사용하여 ^{5,12에 설명된 대}로).
   2. 시퀀싱 라이브러리 깊이를 정규화합니다. 라이브러리를 수동으로 또는 ^5,12와 같이 DESeq2와 같은 내장 함수를 사용하여 정규화합니다. 모든 가이드에 대해 또는 비타깃팅 가이드의 분포를 사용하여 정규화를 수행합니다.
   3. non-targeting sgRNA를 non-targeting 유전자에 무작위로 할당합니다. 예를 들어, 유전자당 4개의 sgRNA가 있는 라이브러리에는 비표적 유전자당 4개의 비표적 sgRNA가 있어야 합니다.
   4. 관심 물질(처리되지 않은/T0 및/또는 처리된/처리되지 않은)의 각 비교에 대해 log2(폴드 변화)를 계산합니다. DESeq2의 파라메트릭 피팅을 사용하여 계산하는 것이 좋지만 폴드 변경의 수동 계산도 수행할 수 있습니다.
   5. 적은 수의 sgRNA를 트리밍합니다. 올바른 트리밍 전략은 반복 실험 간의 노이즈 수준과 이것이 카운트에 따라 어떻게 달라지는지에 따라 달라집니다. 이러한 기능은 CRISPR 라이브러리에 따라 다르며, 새로운 데이터에 대해 여러 컷오프를 병렬로 테스트합니다. 문헌 선례에 기초한 일반적인 컷오프 전략에는 가이드의 가장 낮은 5%를 제거하거나 일부 공칭 임계값¹³ 미만의 가이드를 제거하는 것이 포함됩니다.
2. 아래에 설명된 대로 각 단일 유전자 knockout이 성장 속도에 미치는 영향을 결정합니다.
   1. 처리되지 않은 세포의 순 개체군 성장률(NPG)을 계산합니다(즉, 관찰된 개체군 배가 시간, 그림 1D). 이는 1단계의 FLICK 데이터, 3단계의 시간 경과에 따른 살아있는 세포 수 또는 관심 세포주에 대한 이전 실험 측정에서 추출할 수 있습니다.
   2. MEDUSA는 치료되지 않은 상태를 모델링하기 위해 세 가지 매개 변수가 필요합니다 : NPG : 순 인구 증가율, doublings / h; T_시작: 시작 시점, h. 기본값은 0으로 설정됩니다. Tend_unt: 치료되지 않은 상태의 최종 시점(h)입니다.
   3. NPG 속도에 대한 가능한 모든 섭동을 시뮬레이션합니다. for 루프를 사용하여 가능한 NPG 값의 범위를 평가합니다. 각 상대 성장률에 대해 분석 종말점에서 관찰될 log2(폴드 변화)를 계산합니다.
   4. 4.1.5단계의 각 실험용 sgRNA에 대해 관찰된 데이터에 가장 가까운 시뮬레이션된 접힘 변화를 식별합니다. 시뮬레이션된 fold-change를 초래한 상대적 성장률을 해당 sgRNA에 할당합니다.
3. 성장과 죽음 사이의 조정을 아래에 설명된 대로 특성화하십시오.
   참고: MEDUSA에 필요한 매개변수는 GRADE 분석 방법¹⁴로 분석할 때 FLICK 스타일 데이터에서 추출할 수 있습니다. 이를 위해 (1) 및 (2)의 데이터를 사용하거나 추가 매개변수화 실험을 수행할 수 있습니다.
   1. MEDUSA는 약물이 있는 상태에서 성장과 죽음 사이의 조정을 특성화하기 위해 4가지 매개변수를 사용합니다. GR_drug1: 사망 발병 전 약물 유도 성장률(doubleblings/h); D_O: 사망 발병 시간, h; GR_drug2: 사망 발병 후 약물 유도 성장률(doubleblings/h); DR_약물: 약물로 인한 사망률(Lethal Fraction/h 단위). D_O를 매개변수화하려면 LF kinetics를 사용합니다. LED 핏에서 사망 발병 시간을 추출합니다.
4. LF 동역학을 사용하여 DR_약물 을 측정합니다. 최종 LF를 사망 발병 후 시간(in h)으로 나누어 평균 사망률을 결정합니다.
5. 3단계의 살아있는 세포 계수 데이터에서 GR_drug1 을 측정합니다. 사망이 발생하기 전에 데이터를 간단한 지수 방정식에 피팅하여 약물 유도 성장률을 결정합니다.
   1. 3단계와 약물 GRADE¹⁴의 데이터 조합을 사용하여 GR_drug2를 측정합니다. GRADE 플롯에서 선택한 약물 용량에 대한 GRADE를 계산하고 플롯합니다. GRADE = 0인 경우 GR_drug2를 0으로 가정합니다. GRADE> 0인 경우 GRADE를 사용하여 개체군의 평균 성장률을 확인합니다. GR_drug1에 대해 실험적으로 결정된 값을 기반으로 관찰된 평균 성장률을 초래하는 GR_drug2의 값을 결정합니다.
      참고: 평균 약물 유도 성장률은 관찰된 데이터 포인트(즉, 약물에 대한 GR 및 FV 데이터 쌍)와 GRADE 공간을 구성하는 각 포인트 사이의 쌍별 거리를 계산하고 가장 가까운 포인트를 식별하여 GRADE 플롯에서 추론할 수 있습니다. 자세한 지침은 ref¹⁴를 참조하세요. 약물 유도 성장률 및 사망률은 약물별로 고정된 값이 아니며 주어진 세포 맥락에서 주어진 용량의 약물에 특이적입니다.
6. 아래에 설명된 대로 성장률과 사망률의 가능한 모든 조합에 대해 시뮬레이션된 접힘 변화를 생성합니다.
   1. 약물 유발 성장률과 사망률의 실험적으로 결정된 조정을 사용하여 시간 경과에 따른 약물 유발 인구 규모를 시뮬레이션하는 모델을 구축합니다(그림 1D). 이 모델은 약물 반응의 두 가지 독립적인 단계(사망 전 및 사후 발병 시간)를 결합하는 조각별 함수로 구축할 수 있습니다.
   2. 전체 MEDUSA 모델의 경우 다음 8가지 매개변수를 포함합니다. NPG: 순 인구 증가율(doublings/h); GR_drug1: 사망 발병 전 약물 유도 성장률(doubleblings/h); D_O: 사망 발병 시간, h; GR_drug2: 사망 발병 후 약물 유도 성장률(doubleblings/h); DR_약물: 약물로 인한 사망률(Lethal Fraction/h 단위); T_시작: 시작 시점, h. 기본값은 0으로 설정됩니다. Tend_unt: 치료되지 않은 상태의 최종 시점(h); 경향_tr: 치료된 상태의 최종 시점(h).
   3. 기준선 모델의 경우 가능한 모든 성장 및 사망률 섭동을 시뮬레이션합니다. 각 조합에 대해 관찰 될 log2 (fold-change)를 계산합니다.
      참고: MEDUS에서 성장률에 대한 섭동은 NPG, GR_drug1 및 GR_drug2에 걸쳐 비례하는 것으로 가정합니다. 예를 들어, NPG 비율이 80% 감소하면 약물 유도 성장률도 80% 감소합니다.
7. 아래 설명된 대로 각 녹아웃의 사망률을 추론합니다(그림 1D-E).
   1. 각 sgRNA에 대해 관찰된 폴드 변화를 일으켰을 약물 유도 사망률을 삼각 측량합니다. 먼저 (4.2.4)단계에서 결정된 상대 성장률을 추출합니다.
   2. GR_drug1 및 GR_drug2에 대한 요율을 확인합니다. NPG의 상대 성장률을 적용하여 GR_drug1/GR_drug2의 비례 성장률을 계산합니다.
   3. NPG, GR_drug1 및 GR_drug2에 대한 제약 조건을 사용하여 각 sgRNA(처리/미처리)에 대해 관찰된 접힘 변화에 가장 가까운 시뮬레이션된 접힘 변화를 식별합니다. 이러한 관찰 결과를 조합하여 약물로 인한 사망률을 역계산할 수 있습니다.
8. 아래와 같이 유전자 수준의 성장률과 사망률을 계산합니다.
   1. 라이브러리에 있는 각 유전자에 대한 유전자 수준 비율을 결정합니다. 주어진 유전자와 관련된 모든 sgRNA에 대한 각 성장률 및 사망률의 평균을 계산합니다(일반적으로 4-10).
   2. 경험적 p-값을 계산하려면 sgRNA 수준 데이터를 부트스트랩합니다. Benjamini-Hochberg 절차를 사용하여 FDR 보정을 수행합니다.
      참고: MEDUS를 사용하여 CRISPR 스크리닝 데이터를 분석하기 위한 샘플 데이터와 보완 지침은 GitHub 리포지토리(https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA)에 포함되어 있습니다.

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결과

이 프로토콜을 사용하여 U2OS 세포에서 에토포사이드에 의한 사멸의 유전적 의존성을 조사했습니다. 에토포사이드(Etoposide)는 일반적으로 사용되는 DNA 손상 화학요법이다¹⁵. 이 화학유전학 프로파일링 실험은 U2OS 세포를 발현하는 Cas9의 GeCKOv2 라이브러리¹⁶을 사용하여 수행되었습니다⁵. 이러한 유형의 실험에서 유전자 ?...

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토론

이 프로토콜에서는 유전적 섭동이 약물 유도 성장 및 사망률을 어떻게 변화시키는지 점수를 매기기 위해 화학-유전학 프로파일링 데이터를 정량화하기 위한 MEDUSA 분석 방법의 사용에 대해 설명합니다. 화학-유전자 프로파일링 실험의 주요 결과는 비율이 아니라 개체군 크기와 관련이 있기 때문에 기본 비율은 시뮬레이션을 사용하여 추론됩니다. 따라서 이 방법의 중요?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	For growing cells and optimizing population size
DESeq2	R Package	v1.44.0	For calculating fold-change
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
MATLAB	Mathworks	R2024a	For performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For dead cell measurements
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR library	Addgene	125517	For performing CRISPR screen
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
Trypan blue	Corning	MT25900CI	For measure live/dead cells