우리는 친절 tmuCD40 - 리간드 - 헬라 세포 라인을 제공 클레멘스 박사 Wendtner 감사합니다.

splenocytes에서 murine CD40 - 활성화된 B 세포 (mCD40B)의 생성을 위해 프로토콜은 두 부분으로 나누어져있다 : 부품으로 사용됩니다 판 - 헬라 세포 (tmuCD40L 헬라)를 표현 murine CD40 리간드 (CD40L)의 준비를 보여줍니다 피더 세포를 바운드. 파트 B는 실제 murine CD40 - B 문화를 설명합니다. 피더 세포의 A. 준비 (tmuCD40L 헬라) tmuCD40L 헬라 완전히 합류가해서는 안 자기편 인간 상피 세포주이다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다. <ol><li> 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음. </li><li> 37 10-15분에 75cm 2 플라스크에 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다. </li><li> 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 트립신과 소화를 중지 부드럽게 회전. </li><li> 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 7 분 동안 265 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 제거하고 야생 유형 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 카운트하고 세포의 적절한 수의 세 50 ML 튜브를 준비 : <ol><li> subculture 2.5 X 10 6 세포 </li><li> murine CD40 - B 세포 배양에 사용 / 잘 조사를위한 0.4 X 10 6 세포 </li><li> 프리즈에 나머지 (필요한 경우). </li></ol></li><li> 7분에 대한 265 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 제거합니다. <ol><li> subculturing 들면 : resuspend 2.5 75cm 2 세포 배양 플라스크 10 ML 선택 매체 (세포 밀도 2.5 X 10 5 셀 / ML) 37에서 세포를 품어 X 10 6 세포 ° C와 5 % CO 2. 두 당 주 세포를 분리. </li><li> murine CD40 - B 세포 배양의 경우 : 한 6 자 접시 2.4 X 10 6 세포가 필요합니다. 0.2 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 야생 유형의 매체에 tmuCD40L 헬라 세포를 Resuspend하고 78 쥐에서 그들을 비추다. 물론 각 37에서 그들을 품어 ° C와 5 % CO 2에 세포 현탁액의 플레이트 2 ML. tmuCD40L 헬라 세포가 자기편 때 B - 세포 자극이 준비한 접시를 사용합니다 (최소한 4 시간 : 현미경을 사용하여 준수를 확인, B - 세포 자극을 시작하는 이상 24 H를 기다리지 않는다). (B. 계속) </li></ol></li></ol> B. Murine CD40 - B 세포 배양 CD40 - 자극 (일 공)에 대한 splenocytes의 I. 준비 : 주의 : 당신이 피더 세포가 자기편 것을 확인할 계속하기 전에. 항상 murine 인터루킨 - 4, β - 메르 캅 토 에탄올과 성장 매체 시클 로스 포린 바로 사용하기 전에 새로운 솔루션을 추가합니다. <ol><li> C57BL / 6 마​​우스 (haplotype H - 2B)의 비장을 절개하다하고 10-20 ML DMEM에 두번 씻어 다른 한 튜브에서 10mL 피펫 팁로 전송하여 Gentamycin [15μg/mL]로 보충. 마우스의 전송 오염 물질 (예 : 머리카락)하지 마십시오. 셀 스트레이너 (100μm)를 통해 전달하여 비장을 말하다 및 매체의 또 다른 10 ML와 스트레이너를 헹굴. 상온에서 7 분 265 XG에 splenocytes를 스핀 다운, 7mL muCD40 - B의 세포 매체 및 Ficoll 밀도 원심 분리하여 별도의 lymphocytes들을 resuspend. 그렇게 30 분 450 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기 5 ML 마우스 Pancoll (실온에서 preheated)에 레이어 셀을 상온에서 브레이크없이 할 수 있습니다. </li><li> 인터페이스에서 그대로 림프구 계층을 떠나, 상위 레이어의 대부분을 그립니다. 새로운 50 ML 튜브에 림프구 계층을 전송, 기타 세포를 제거 7 분 265 XG에 가서 회전에 의해 Gentamycin [15μg/mL]와 30mL DMEM과 함께 한 번 씻는다. 뜨는을 취소하고 mCD40 - B 세척 매체 10 ML에있는 세포를 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 확인합니다. 세포 현탁액의 나누어지는를 세어 휴대폰 번호를 확인합니다. </li><li> 7분에 대한 265 XG에서 세포의 필요한 양을 스핀 다운. 6 잘 플레이트 5 X 10 6 세포 / 잘 따라서 판 30 X 10 6 셀 필요합니다. </li><li> 뜨는를 제거하고 성장 요소로, 시클 로스 포린 100 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올 및 0.63 μg / ML은 방지하기 위해 갓 1 U / 인터루킨 - 4의 ML과 보충 mCD40 - B 문화 매체 1.25 X 10 6 세포 / ML에서 lymphocytes을 resuspend T - 세포의 가지 (감안할 때 농도가 한 ML 문화 매체를 참조!). </li><li> 6 잘 플레이트 tmuCD40L 헬라 세포로 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 6 잘 접시의 각각 잘 수있는 림프구 정지 4 ML (1.25 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다. </li><li> 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2. </li&gt; <li> 일 3 전지 (II.1 계속.) reculture. </li></ol> II. mCD40B 세포 (3 일 후 일주일에 두 번)의 Subculture : <ol><li> 노골적인 협상을 50 ML 튜브에 10 ML의 피펫과 수영장 그들과 함께 위아래로 pipetting하여 수확 mCD40B 전지 클러스터. </li><li> 7분에 대한 265 XG에 스핀 다운 및 완전히 mCD40 - B 세척 매체로 뜨는 교체하십시오. 나누어지는의 세포 금액을 계산하는 동안, 7 분 동안 265 XG에서 세포를 스핀 다운. 0.75 X 10 6 세포 / ML의 농도에서 mCD40 - B 문화 매체 Resuspend mCD40B 세포. </li><li> 1 U / ML, 100 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올의와 매체 시클 로스 포린 0.63 μg / ML의 농도에서 인터루킨 - 4 murine의 새로운 솔루션을 추가합니다. </li><li> 6 잘 플레이트 조사 tmuCD40L 헬라 세포로 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 6 잘 접시의 각각 잘 수있는 mCD40B 세포 현탁액 (0.75 X 10 6 세포 / ML) 4 ML를 추가합니다. </li><li> 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2. </li><li> 다시 모든 3~4일 14 일 총 후에 매우 순수 murine CD40 - B 세포 활성화와 최종 수있는 세포가 subculture. </li></ol> C.의 문제 해결 : 어떤 경우 CD40 - B 세포 성장하지? <ol><li> 당신은 피더 세포의 CD40 리간드 발현에 대한 검사 있습니까? </li><li> 24 세 이상 자극에 사용되는 플레이트 - 바운드 피더 세포 있습니까? </li><li> mycoplasma와 오염이 있나요? </li><li> 보완을 위해 사용되는 인터루킨 - 4 솔루션은 신선한 해동이고 이것은 적절한 생물 학적 활동을 있었나요? </li><li> β - 메르 캅 토 에탄올과 시클 로스 포린 A는 정확한 농도에 추가습니까? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1A. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="그림 1 B" /> 그림 1B. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="그림 1 D" /> 그림 1D. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2.

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	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. 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L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

실험은 실험실 동물 관리 방법에 대한 국내 및 유럽 지침에 따라 수행되었다. 독일의 동물 복지 법률을 참조하면 동물이 적절한 당국에 의해 정기적으로 제어되었다.

이 프로토콜의 수정은 특히도 murine CD40가 활성화된 B 세포의 효율적인 세대에 항복, CD40 - 자극 및 사용 마우스 변형의 유형의 기원에 대해 가능합니다. 아마디 외. CD40 - 리간드와 transfected murine 마우스 섬유아 세포에 대한 유사한 결과를 보여주었다. 외부의 항원이 맞는 프레 젠 테이션에서 확실하게 제외하지만, 보안 및 생체내의 독성에 관한 집중 연구는 인간의 transfected 헬라 세포를 사용?...

미디어 A. 준비 : <table border="1"><tbody><tr><td> 피더 세포 야생 유형 매체 </td><td> 피더 셀 선택 매체 </td><td></td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 집중 </td><td> 시약 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 300 μg / ML </td><td> L - 글루타민 </td><td> 300 μg / ML </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 MM </td><td> HEPES </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0.2 MG / ML </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40 - B 세척 매체 </td><td> mCD40 - B 문화 매체 </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 집중 </td><td> 시약 </td><td> 집중 </td></tr><tr></tr><tr><td> D - 멤 </td><td> </td><td> D - 멤 </td><td> </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 580 μg / ML </td><td> L - 글루타민 </td><td> 580 μg / ML </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 4.5 MG / ML </td><td> 포도당 </td><td> 4.5 MG / ML </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 MM </td><td> HEPES </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> 멤 </td><td> 0.1mM (1X) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. 기타 시약 : <table border="1"><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 아니오를 주문하지 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21,875 </td></tr><tr><td> D - 멤 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41,965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10X) </td><td> PAA </td><td> 고양이도없는 H15 - 011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> 델타 선택 </td><td> 예술 없음 7,395,800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> 고양이도없는 DE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 </td><td> PAA </td><td> 고양이도없는 S11 - 001 </td></tr><tr><td> 멤 NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11,140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> 고양이도없는 P02 - 015 </td></tr><tr><td> 인터루킨 - 4 재조합 Murine </td><td> Immunotools </td><td> 고양이도없는 12,340,045 </td></tr><tr><td> 시클 로스 포린 </td><td> 노바티스 </td><td> 고양이도없는 NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. 기타 용품 : <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 아니오를 주문하지 </td></tr><tr><td> 멸균 피펫 팁 </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 웰 플레이트 </td><td> NUNC </td><td> 고양이도 140,675 </td></tr><tr><td> 50mL 원뿔 관 </td><td> BD 팰컨 ™ </td><td> 고양이도 352,070 </td></tr><tr><td> 조직 문화 플라스크 </td><td> Sarstedt </td><td> 고양이도없는 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

B 세포에 관한 연구는 CD40 활성화들은 항원 프레 젠 테이션 능력을 향상하는 것으로 나타났습니다. 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극을 때, 인간의 B 세포는 고도로 순수 CD40 - B 세포 (매우 큰 금액을 14 일 이내에 말초혈 소량의 어려움없이 확장 가능&gt; 10<sup&gt; 9</sup건강한 기증자뿐만 아니라 암 환자에서 환자마다&gt; 전지)<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40 - B 세포 중요한 림프절 유도 분자를 표현하고 T 세포를 유도할 수<em&gt; 체외에서</em<sup&gt; 5</sup&gt;. 또한 그들은 효율적으로 T 세포, 프로세스와 현재의 항원을 차지<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40 - B 세포는 주요 순진하지에만 표시뿐만 아니라 메모리 T 세포를 확장했다<sup&gt; 8,9</sup&gt;. 따라서 CD40 - 활성 B 세포 (CD40 - B 세포)의 대체 소스로 연구되었습니다 단백질 stimulatory 항원 제시 세포 기반 immunotherapy1, 5,10를위한 세포 (APC)를. CD40 - B 세포가 생체내 효과적인 T 세포 반응을 유도하고 우리가 murine CD40 - 활성 B 세포의 생성을위한 세포 배양 시스템을 확립 기본 메커니즘을 연구 여부를 진학하기 위해서는. splenocytes를 사용하거나 CD40 - 정품 인증 C57BL / 6 마​​우스에서 B 세포를 정화, 최적의 조건은 다음과 같이 확인되었습니다 : C57BL / 6 마​​우스 (haplotype H - 2B) lymphocytes의 splenocytes의 시작은 밀도 기울기 원심 분리와 헬라와 함께 공동 양식에 의해 정화 아르 재조합 murine CD40 리간드 (tmuCD40L 헬라)를 표현 세포<sup&gt; 11</sup&gt;. 세포 3-4일 모든 recultured하고 같은 CD40L, 인터루킨 4와 같은 주요 구성 요소는 - 메르 캅 토 에탄올과 시클 로스 포린 A은 보충함 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 인간 CD40 - B 세포 (그림 1A, B)에 APC - 표현형 유사한 완벽하게 활성화 murine CD40 - B 세포 (mCD40B)을 구하는 방법을 보여줍니다. CD40 - 자극은 세포 배양 후 14 일 이내에 신속한 가지 고도 순수 (&gt; 90%) CD19 + B 세포의 확장 (그림 1C, D)에 연결됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에 murine CD40 리간드 표현 (그림 2) 정기적으로 제어되어야한다. Murine CD40 - 활성 B 세포는 체외에서 생체내의 APC로 함수 자신의 잠재력을 조사하기 위해 B - 세포 활성화와 차별화뿐만 아니라 공부를하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 예방 접종을 수립을위한 유망한 도구를 대표하고 안전과이 방법의 immunogenicity에 관한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다<sup&gt; 12</sup&gt;.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

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Immunology and Infection

12.5K 조회수.  University Hospital of Cologne. 이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.