이 프로토콜을 사용하여 장에서 면역 세포의 phenotypic 분석에서 격리는 GI및 전신 염증 장애의 이해에 적용 할 수 입증했다. 이 방법은 플뢰르의 아토미트리 또는 기타 방법에 의해 후속 면역 현상기를 허용하는 오염 된 파편을 최소화하여 실행 가능한 단일 핵 세포의 상당수를 격리합니다. 장이 많은 질병에 있는 염증의 주요 표적 사이트이기 때문에, 이 프로토콜은 암, 알레르기, 이식 및 자기 면역의 마우스 모형에 있는 장 면역 집단의 연구 결과에 유용할 지도 모릅니다.
이 프로토콜의 수율과 효율성을 최적화하려면 주요 솔루션과 재료를 미리 준비하는 것이 좋습니다. 마우스를 안락사시키고 수직 중간선 절개를 한 후 미세 해부 가위를 사용하여 회랑을 엽니다. 집게를 사용하여 작은 창자를 한쪽으로 이동하고 내림차순 결장이 노출됩니다.
내림차순 결장위로 약간 위로 당겨 결장의 직장 부분을 최대적으로 노출시합니다. 그런 다음, 골반 깊숙이 해회 직장을 잘라 세칼 캡에 실외 창자에서 하나의 단위로 전체 결장해. 첫째, 축축한 종이 타월에 결장들을 놓고 가위 나 집게 한 쌍의 무딘 끝을 사용하여 창자 벽에 가벼운 압력을 가하고 고체 대변을 추출하십시오.
다음으로, 결장들을 페트리 접시에 놓고 18게이지 무딘 채워진 바늘로 10 밀리리터 주사기를 사용하여 차가운 결장 버퍼 10밀리리터로 용기를 플러시합니다. 콜론을 5-10 밀리리터의 차가운 결장 버퍼로 가득 찬 페트리 접시에 놓고 나머지 식민지 내용을 씻기 위해 수동으로 교반하십시오. 이 워시를 2-3회 반복하여 각 세척에 신선한 버퍼가 들어 있는 새로운 페트리 접시를 사용하십시오.
그 후, 콜론을 신선한 냉장 결장 버퍼가 들어 있는 새로운 페트리 접시로 옮춥니다. 결장은 더 근육질의 직장 끝에서 근위 결장까지 세로로 잘라서 단일 직사각형 열린 결장 조각을 생성합니다. 접시의 중앙값을 버리고 깨끗한 차가운 결장 버퍼로 대체하십시오.
직사각형 결장 조직을 결장 버퍼로 축화한 종이 타월에 놓고 수평으로 잘라서 작은 조각으로 자릅니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 콜론 조각을 수집 50 밀리 리터 폴리 프로필렌 원추형 튜브 포함 20 차가운 결 장 버퍼의 밀리 리터. 그런 다음 튜브를 30초 동안 적극적으로 소용돌이시켜 조각을 씻습니다.
세척 후, 조직 조각이 차혈을 탈피하거나 진공 청소기 전에 튜브의 바닥에 정착하자, 조직 조각을 잃지 않도록확인, 각 세척에 대한 신선한 결장 버퍼를 사용하여이 전체 세척 과정을 3 번 반복. 시작하려면 세척된 결장 조각을 포함하는 튜브에 콜라게나아제 소화 버퍼 20 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 밀봉하고 60 분 동안 2 회 G의 회전 속도로 섭씨 37도에서 궤도 셰이커에 놓습니다.
조직 파편이 교반 중에 일정한 움직임에 있는지 확인하십시오. 먼저, 66%의 실리카 기반 밀도 분리 매체를 각각 3개의 분리된 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 붓습니다. 다음으로, 콜라게나제 소화 1에서 상퍼만 수집하기 위해 25 밀리리터 세로지오티 파이펫을 사용합니다.
깨끗한 50 밀리리터 폴리 프로필렌 원간 튜브에 배치 40 마이크로 리터 가난한 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 상체를 필터링합니다. 차가운 결장 버퍼로 튜브를 완전히 채우면 콜라게나아제 소화 버퍼를 담금질하십시오. 그런 다음 세포를 회전시키고, 슈퍼나티를 흡인하고, 펠릿을 얼음 위에 두십시오.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜라게나아제 소화 2를 계속 수행합니다. 콜라게나아제 소화 2가 완료된 후, 18게이지 무딘 엔드 바늘을 통해 튜브와 10 밀리리터 주사기 사이에 조직 조각을 적극적으로 앞뒤로 플러시합니다. 적어도 7-8 개의 구절에 대한이 플러시를 반복, 총 조직 파편이나 debri가 볼 때까지 계속.
다음으로, 40 마이크로미터 가난한 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 조직 분리 현탁액을 깨끗한 50 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 넣습니다. 차가운 결장 버퍼로 튜브를 림에 채우고 소화와 원심분리기를 섭씨 4도에서 섭씨 4도에서 5분간 담금질합니다. 진공 포부를 통해 상체를 버리고 콜라게나제 소화 1에서 해당 튜브로 재 부유 한 펠릿을 당깁니다.
그 후, 콜론당 44%실리카 기반 밀도 분리 매체의 24밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단한다. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 66% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 포함하는 3개의 튜브에 이 매체의 8 밀리리터를 천천히 층으로 부릅니다. 계량 스케일 또는 균형을 사용하여 원심분리기 버킷 내의 튜브의 균형을 신중하게 조정합니다.
원심분리기는 섭씨 20도에서 859회 G로 20분간 쉬지 않고 휴식을 취합니다. 로더가 튜브를 제거하기 전에 휴식을 취하도록 허용하고 그라데이션 인터페이스에서 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오. 첫째, 일반적으로 1-2 밀리리터 두께의 흰색 밴드가 존재하는 5 밀리리터 마크 근처의 그라데이션 인터페이스를 시각화합니다.
진공 흡인및 인터페이스에 쉽게 파이펫 액세스를 허용하기 위해 그라데이션의 상위 7 밀리리터를 폐기합니다. 연속 수동 흡입 및 꾸준한 회전 손목 모션을 사용하여 셀의 인터페이스 레이어를 수집합니다. 두 그라데이션 사이의 인터페이스가 명확하고 재구성될 때까지 수집하고 인터페이스를 새로운 50 밀리리터 폴리프로필렌 원내 튜브로 전송합니다.
다음으로 총 서스펜션이 50밀리리터에 도달할 때까지 FACS 버퍼를 이 욕조에 추가합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 800배 G로 5분간. 그런 다음, 진공 포부를 통해 상류체를 흡인하고 FACS 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
이 비디오에 설명된 절차는 결장에서 단핵 세포를 분리하거나, 수정과 함께, 소장으로부터 분리하는 데 사용할 수 있다. 또한 세포측정및 데이터 분석은 분리를 위해 콜라게나아제 E 또는 D를 사용할 때 세포 및 괴사/죽은 림프구의 분획을 DNAse 1 치료 없이 당사와 비교하기 위해 수행됩니다. 별관 에 이어 5 각 절연 다음 단일 세포 현탁액에 고정 된 살아있는 죽은 푸른 염료 염색, DNAse없이 콜라게나아제 E는 DNAse없이 콜라게나아제 D에 비해 격리 후 라이브 셀의 상당히 높은 비율을 보였다.
DNAse와 콜라게나아제에 비해 경우에도 마찬가지입니다. 또한 콜라게나아제 D군의 90.0%에 비해 콜라게나아제 E군에서 괴사 세포를 41.0%의 중간 비율로 확인하였다. 콜라게나세 E DNAse 그룹에서 75.9%, 콜라게나아제 DNAse 그룹에서 80.3%를 차지했다.
다중 계측흐름 세포측정은 BMT 또는 동종 또는 합성 BMT 모델을 받은 후 7일째 CD45.2 밸브-C 수신자 마우스로부터 분리된 MNC에 적용된다. BMT 수령인의 결장에서 추출된 기증자 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포의 평균 절대 숫자는 계산되고 비교된다. 따라서 이러한 마우스 모델에서 희귀 면역 세포 집단을 식별 및/또는 수량화하는 것이 중요할 수 있습니다.
기증자 유래 FOX-P3 양성 T 조절 세포를 포함하는 희귀 한 하위 세트는 합성 및 동종 BMT 모델 모두에서 평가됩니다. 이 방법을 사용하여, 심지어 희귀 한 하위 집합, 기증자 파생 된 대장 T 조절 수신자 마우스 결장에 침투, BMT 후, 분석 될 수있다. 콜라게나아제 E는 섭씨 37도에서 활동한다는 점에 유의해야 합니다.
따라서 모든 콜라게나아제 솔루션은 적절한 콜라게나아제 활동을 위해 미리 데워지고 활동을 종료하도록 철저히 담금질해야 합니다. 이 프로토콜은 플뢰르 세포측정, 분자 생물학 기술, 현미경 검사법, 배양 및 그 외의 사이트에 의해 후속 특성화에 사용될 수 있는 많은 수의 단일 핵 세포를 허용합니다. 이 프로토콜은 골수 이식 모형에 있는 실험 대 통제마우스의 결장에 있는 염증의 믿을 수 있는 평가를 제공했습니다.
따라서 이식 내성의 새로운 규제 면역 메커니즘의 발견을 촉진. 클로스트리디움 이스토리티쿰의 콜라게나제는 실험실 안전 기술로 처리해야 하는 시약입니다. 흡입시 건강에 해를 끼치고 피부와 눈 자극을 유발할 수 있습니다.
