먼저, 143B 인간 골육종 세포를 6웰 플레이트에 시딩한다. 세포가 75% 융합되면 각 웰의 배지를 10밀리몰 13C4 아스파르테이트가 포함된 배지로 교체하고 8시간 동안 배양하여 세포 표지를 위한 정상 상태를 달성합니다. 대사 산물을 분리하려면 준비된 완충액을 섭씨 영하 80도에서 밤새 식히거나 드라이 아이스에 올려 놓으십시오.
한편, 인큐베이터에서 플레이트를 가져 와서 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 흡인합니다. PBS로 2회 세척한 다음, 추가로 진행하기 전에 잔류 PBS를 제거한다. 이제 플레이트를 드라이 아이스에 놓고 800 마이크로 리터의 준비된 완충액을 각 웰에 첨가하십시오.
세포 용해를 촉진하기 위해 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포 리프터를 사용하여 드라이아이스에서 각 웰을 긁어내고, 용해물을 드라이아이스 위에 놓인 15밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 소용돌이치고, 섭씨 4도에서 10분 동안 17, 000g으로 원심분리한다.
그런 다음 상층액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 약 6 시간 동안 고진공 하에서 콜드 트랩이있는 섭씨 4도 진공 농축기에서 건조시킵니다. 건조된 대사산물 펠릿을 영하 80°C에서 추가로 사용할 때까지 보관하십시오. 액체 크로마토그래피 질량 분석법 또는 LCMS를 사용하여 샘플을 분석하려면 HPLC 등급의 물 100마이크로리터를 건조된 펠릿에 넣고 그림과 같이 와동시킵니다.
샘플을 섭씨 4도에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 25 마이크로리터의 상청액을 LCMS 바이알에 옮기고 2 마이크로리터를 LCMS 시스템에 주입합니다. 액체 착색 검사를하기 위하여는, 이동 상 B의 gradient 형태의 밑에 분 당 0.15 밀리리터의 일정한 흐름율을, 20 내지 20%for 20 분, 20에서 80%for 0.5 분, 및 이동상 A.Next에 대하여 80%for에 대하여 7.5 분에 대하여 유지하십시오, mz 70 대 1 사이에서 가득 차있는 검사를 선택해서 질량 분광법을 실행하십시오, 000 달튼.
그리고 70, 000의 해상도. AGC 목표를 10의 1배에서 6분의 1로 설정하고 최대 주입 시간을 20밀리초로 설정합니다. 그런 다음 런타임을 16.5분으로 설정합니다.
극성이 양수로 설정되었습니다. AGC 목표는 1의 5의 거듭제곱으로 설정됩니다. 최대 IT는 20밀리초로 설정되었습니다.
그리고 스캔 범위는 70 대 1, 000 질량 대 충전 비율로 설정됩니다. 그런 다음 스프레이 전압을 3.0킬로볼트로 설정합니다. 그리고 섭씨 275도에서 가열된 모세관.
40 단위에서 시스 가스 흐름, 15 단위에서 보조 가스 흐름, 한 단위에서 스윕 가스 흐름을 선택합니다. 13C5 글루타민 동위원소 추적의 경우 세포가 75% 밀도에 도달하면 배지를 2밀리몰 13C5 글루타민 함유 배지로 변경하고 배양하여 관심 있는 세포를 안정적으로 라벨링합니다. 이전에 입증된 대로 대사 산물을 분리하고 분석합니다.
대사산물을 분리 및 분석한 후, 13C3 푸마레이트, 13C4 푸마레이트, 13C3 숙시네이트 및 13C4 숙시네이트의 표지 백분율을 계산하여 숙신산 탈수소효소 또는 SDH 활성을 분석합니다. 그런 다음 공식을 사용하여 숙신산 산화 및 푸마레이트 환원을 평가합니다. 비히클-처리된 조건에서, SDH 복합체는 순방향 활성을 선호하고, 13C4 푸마르산염으로의 13C4 숙시네이트의 혼입은 13C3 석시네이트로의 13C3 푸마레이트보다 더 높았다.
항마이신 처리된 골육종 세포에서 SDH 복합체는 역활성을 선호했으며 13C3 석시네이트로의 13C3 푸마레이트의 혼입은 13C4 석시네이트를 13C4 푸마르산염으로 통합하는 것보다 더 중요했습니다.
