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DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

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저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.

포유류의 미토콘드리아가 분자 산소를 소비하지 않고도 기능할 수 있다는 새로운 연구가 입증됨에 따라 연구자들은 미토콘드리아 기능을 정확하게 정량화하기 위해 OCR 측정을 넘어 직교 분석을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아 NAD+/NADH 균형, 적응 말단 전자 수용체의 활용, ATP 생성, de novo 피리미딘 생합성 및 미토콘드리아 유래 ROS를 측정하여 복합체 I, 복합체 II, 복합체 V 및 DHODH의 활성을 직접 평가하는 데 사용할 수 있는 일련의 분석을 수집했습니다. 특히, 이러한 분석은 OCR 측정보다 미토콘드리아 기능을 더 직접적으로 측정합니다. 또한, 이러한 분석은 연구자들에게 저산소증 동안 미토콘드리아 기능을 정량화할 수 있는 다루기 쉬운 방법을 제공하며, 이는 푸마레이트가 선호되는 말단 전자 수용체로 사용되기 때문에 OCR 측정이 크게 관련이 없습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 증식 기반 방법은 기존의 호흡기 측정 실험보다 비용 효율적이므로 포유류 시스템에서 미토콘드리아 기능을 연구할 수 있는 광범위하게 접근 가능한 방법을 제공합니다.
배양된 세포에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 이러한 분석을 사용할 때 주요 고려 사항이 있습니다. 증식 분석과 관련하여, 각 세포주의 배가 속도를 위해 시딩된 세포의 수를 조정하는 것이 중요하다. 세포는 증식의 차이를 정량화할 수 있도록 최소 10%의 합류점과 3-4배의 배가를 허용할 수 있는 충분한 공간이 있어야 합니다. 각 분석에 대한 또 다른 고려 사항은 각 ETC 복합체의 활성에 대한 대조군으로 사용되는 소분자의 농도입니다. 서로 다른 세포주가 이러한 억제제에 대해 서로 다른 민감도를 나타낼 수 있으므로 최적의 농도를 확인하기 위해 이러한 소분자의 용량을 테스트하는 것이 중요합니다.
OCR 측정 및 여기에 설명된 모든 분석을 포함하여 시험관 내에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 분석의 보편적인 한계는 배양 배지의 대사 구성입니다. 표준 세포 배양 배지는 시스템을 표면적으로 높은 수준의 미토콘드리아 기능으로 편향시키는 경향이 있습니다. 예를 들어, 초생리학적 글루타민 수치는 미토콘드리아 NADH 합성을 촉진하고 결과적으로 산화적 인산화를 증가시키는 TCA 주기25의 역고세균을 증가시킵니다. 유사하게, 산소 분압은 포유동물 조직에서 3 mmHg 내지 100 mmHg (대략 0.1%-13%O2) 사이이지만, 시험관 내에서는 대기 (140 mmHg, 대략 21%)이다 26,27. 이러한 과잉O2는 미토콘드리아 호흡 능력과 과산화물 생산을 최대화한다28. 최근에, 보다 생리학적으로 배양 배지를 설계하려는 노력이 이루어지고 있다29,30. 특히, 인간 혈장 유사 배지에서 세포를 배양하면 일부 암 세포주(30)에서 미토콘드리아 호흡, T 세포(31)에서 미토콘드리아 ROS, 암 치료제에 대한 미토콘드리아 적응(32)이 감소합니다. 따라서 사용되는 배양 배지의 구성을 염두에 두고 이것이 미토콘드리아 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아 기능의 해석에서 또 다른 중요하고 보편적인 한계는 미토콘드리아 수의 차이에 대한 가능성입니다. 그러므로, mtDNA33의 정량화, 막 전위-비감응성 염료(34)를 이용한 미토콘드리아 질량의 측정, 또는 미토콘드리아 마커의 웨스턴 블로팅을 통해 미토콘드리아 함량을 측정하는 것이 중요하다. 이것은 미토콘드리아 수의 감소가 미토콘드리아 기능의 감소로 오인되지 않도록 하는 중요한 제어입니다.
여기에 설명된 분석에 적용되는 특정 제한 사항 및 문제 해결도 있습니다. 첫째, 분화된 세포가 증식하지 않는다는 점을 감안할 때, 증식 기반 분석은 이러한 맥락에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 유용하지 않을 것입니다. DHODH 활성을 측정하기 위한 13C4-아스파르테이트 추적 프로토콜의 주요 한계는 세포에서의 아스파르테이트 흡수가 매우 비효율적일 수 있다는 것이다35. 이러한 잠재적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 아스파르테이트 수송체인 SLC1A3을 과발현시켜 13C4-아스파르테이트 흡수를 촉진할 수 있다35.
SDH 활성을 측정하기 위해 13C5-글루타민 추적을 사용하는 프로토콜의 한계는 이 분석에서 세포가 역활성을 측정하기 위해 M+3 동위원소를 풍부하게 하기 위해 환원성 카르복실화 경로를 활용해야 한다는 것입니다. 일부 세포주는 낮은 ATP 시트레이트 분해효소 발현36, 불충분한 HIF 안정화 37, 또는 너무 낮은 α-KG:시트레이트 비율38로 인해 환원성 카르복실화 플럭스가 불가능합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, SDH 정방향 및 역방향 활성을 측정하기 위해 13C4-아스파르테이트 추적을 이용할 수 있다7. 이 분석에서, SDH 정방향 활성은 푸마르산염 M+2:숙시네이트 M+2의 비율과 숙신산염 M+4:푸마르산염 M+4에 의한 역반응에 의해 측정될 수 있다. 특히, 이 추적은 환원성 카르복실화 경로에서 대부분의 효소를 우회합니다.
판독으로 DCPIP 감소를 사용하는 복합체 I 활성 분석의 한계는 미토콘드리아가 구조적으로 손상되지 않는다는 것입니다. 분석을 위한 그들의 NADH 흡수를 가능하게 하기 위해 미토콘드리아를 동결-해동시키는 과정은 확실히 미토콘드리아 막의 구조적 완전성을 손상시킬 수 있다39. 이 분석은 관찰된 복합체 I 활성의 변화가 온전한 세포에서도 사실임을 보장하기 위해 복합체 I 증식 분석과 같은 분석과 병행하여 수행되어야 합니다.
향후 연구에서 이러한 기술 중 일부는 마우스 및 Caenorhabditis elegans 와 같은 모델 유기체를 사용하여 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 적용될 수 있습니다.생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용되는 현재 방법은 유기체 수준 OCR, 특히 마우스 모델을 사용할 때의 호흡 교환률에 중점을 둡니다. 이 방법의 분명한 한계는 산소가 미토콘드리아 ETC에서 유비쿼터스 말단 전자 수용체로서의 역할을 넘어 많은 생화학적 및 신호 전달 기능을 수행한다는 것입니다. 예를 들어, 산소는 디옥시게나제 계열의 효소의 촉매 활성에 의해 "소비"됩니다. 이러한 효소는 세포 산소 소비율에 기여하지만 미토콘드리아 기능에 참여, 조절 또는 반영하지 않습니다. 시험관 내 고전적인 호흡 측정 실험은 일반적으로 "비미토콘드리아 OCR"을 제어하는 반면, 유기체 호흡 교환비(RER) 실험은 이를 제어할 수 없으므로 RER을 생체 내 미토콘드리아 기능에 대한 메트릭으로 해석하는 것이 제한됩니다. 그러나, 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 13C4-아스파르테이트 추적을 통한 DHODH 활성, 13C5-글루타민 추적을 통한 복합체 II 활성, 조직으로부터 정제된 미토콘드리아에 대한 복합체 I 활성, 및 미토콘드리아 ROS를 통해 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 프로토콜을 적용하는 것이 가능하다. 미토콘드리아 기능을 조사하기 위한 이러한 직접적인 분석은 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 연구자들에게 포유류 세포 및 조직의 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적이고 정확한 평가를 제공합니다.

미토콘드리아 기능은 포유류 세포에서 중요한 생합성, 생체 에너지 및 신호 전달 기능을 유지하기 때문에 세포 건강의 중요한 지표입니다1. 대부분의 미토콘드리아 기능은 전자 수송 사슬(ETC)을 통한 전자 흐름을 필요로 하며, ETC의 전자 흐름 중단은 심각한 미토콘드리아 질환을 유발합니다2. ETC는 내부 미토콘드리아 막에 내장된 일련의 환원 및 산화(산화환원) 반응으로 구성되며, 이러한 전자 전달 반응은 ATP 합성, 열 발생과 같은 생리학적 과정, 새로운 피리미딘 생합성과 같은 생합성 경로 및 NADH와 같은 보조 인자의 산화 환원 상태의 균형을 지원하는 데 활용할 수 있는 자유 에너지를 방출합니다. ETC 복합체 I 및 III은 활성 산소 종(ROS)3,4,5를 생성하며, 이는 차례로 HIF, PI3K, NRF2, NFκB 및 MAPK6과 같은 신호 전달 주요 경로를 조절합니다. 결과적으로, ETC의 전자 흐름 메트릭은 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능의 프록시로 고전적으로 사용됩니다.
호흡 측정 실험은 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 자주 사용됩니다. O2는 포유류 ETC에 대한 가장 보편적인 말단 전자 수용체이기 때문에 그 환원은 미토콘드리아 기능의 프록시로 사용됩니다. 그러나 포유류의 미토콘드리아는 새로운 피리미딘 생합성7, NADH 산화7,황화수소 해독8을 포함하여 ETC에 의존하는 미토콘드리아 기능을 유지하기 위해 푸마레이트를 전자 수용체로 사용할 수 있음을 보여줍니다. 따라서, 특정 상황에서, 특히 저산소 환경에서,O2 소비율 (OCR)의 측정은 미토콘드리아 기능의 정확하거나 정확한 지시를 제공하지 않는다.
여기에서는 OCR과 독립적으로 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용할 수 있는 일련의 분석에 대해 간략하게 설명합니다. 자사는 복합체 I-매개 NADH 산화, 디히드로오로테이트 탈수소효소 매개 de novo 피리미딘 생합성, 복합체 V-의존성 ATP 합성, 숙신산 탈수소효소(SDH) 복합체의 순 방향성 및 미토콘드리아 유래 ROS를 직접 측정하기 위한 분석을 제공합니다. 이러한 분석은 배양된 포유류 세포에서 수행되기 위한 것이지만, 많은 세포 가 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.특히, 이 프로토콜에 설명된 분석은 OCR보다 미토콘드리아 기능의 보다 직접적인 측정입니다. 또한, 저산소증에서 미토콘드리아 기능의 측정을 가능하게 하며, 이는 OCR이 지표 측정이 아닌 맥락입니다. 종합하면, 이러한 분석은 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 연구자들에게 포유류 세포의 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;1.5 mL tube</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>667443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tube</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C4-aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>604852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C5-Glutamine</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>285978-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>667411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>667421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dish</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichlorophenolindophenol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascentis Express C18</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53825-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter 500 mL, 0.22 &#181;m, PES 9 9 mm membrane diameter</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brequinar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap -105 Cold Trap</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7385020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Cups</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decylubiquinone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5943000343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine-free DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>460801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade MeOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>900688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Osteosarcome Cell Line 143B</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotone buffer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSox Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885502-0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate-free DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReCO2ver Incubator</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&#956;m 150 x 2.1 mm analytical column</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.50460.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-pHILIC guard kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.50438.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellets</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>567530-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OPTON-31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VF-S01-A-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 Coulter Particle count and size analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BZ10131270</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-independent assays to measure mitochondrial function in mammals

미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)의 전자 흐름은 포유류 세포에서 다면적 생합성, 생체 에너지 및 신호 전달 기능을 지원합니다. 산소(O2)는 포유류 ETC에 대한 가장 보편적인 말단 전자 수용체이기 때문에O2 소비율은 미토콘드리아 기능의 프록시로 자주 사용됩니다. 그러나 새로운 연구에 따르면 푸마레이트는 저산소증에서 미토콘드리아 기능을 유지하기 위한 대체 전자 수용체로 사용될 수 있기 때문에 이 매개변수가 항상 미토콘드리아 기능을 나타내는 것은 아닙니다. 이 기사는 연구자들이 O2 소비율과 독립적으로 미토콘드리아 기능을 측정할 수 있도록 하는 일련의 프로토콜을 컴파일합니다. 이러한 분석은 저산소 환경에서 미토콘드리아 기능을 연구할 때 특히 유용합니다. 구체적으로, 우리는 미토콘드리아 ATP 생산, 새로운 피리 미딘 생합성, 복합체 I에 의한 NADH 산화 및 과산화물 생산을 측정하는 방법을 설명합니다. 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 이러한 직교하고 경제적인 분석은 연구자들에게 관심 시스템에서 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다.

Mitochondrial function is a critical metric of cellular health, as it sustains key biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells1. The vast majority of mitochondrial functions require electron flow through the electron transport chain (ETC), and disruptions in electron flow in the ETC cause severe mitochondrial disease2. The ETC is comprised of a series of reduction and oxidation (redox) reactions that are embedded in the inner mitochondrial membrane, and these electron transfer reactions release free energy that can be harnessed to support ATP synthesis, physiological processes such as thermogenesis, biosynthetic pathways such as de novo pyrimidine biosynthesis, and the balance of the redox status of co-factors such as NADH. ETC complex I and&#160;III produce reactive oxygen species (ROS)3,4,5, which, in turn, regulate signaling key pathways such as HIF, PI3K, NRF2, NF&#954;B, and MAPK6. Consequently, metrics of electron flow in the ETC are classically used as a proxy for mitochondrial function in mammalian cells.
Respirometry experiments are frequently employed to measure mitochondrial function in mammalian cells. Since O2 is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, its reduction is used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging evidence demonstrates that mammalian mitochondria can employ fumarate as an electron acceptor to sustain mitochondrial functions that depend on the ETC, including de novo pyrimidine biosynthesis7, NADH oxidation7, and the detoxification of hydrogen sulfide8. Thus, in certain contexts, especially in hypoxic environments, measurements of the O2 consumption rate (OCR) do not provide a precise or accurate indication of mitochondrial function.
Here, we outline a series of assays that can be employed to measure mitochondrial function independently of the OCR. We provide assays to directly measure complex I-mediated NADH oxidation, dihydroorotate dehydrogenase-mediated de novo pyrimidine biosynthesis, complex V-dependent ATP synthesis, the net directionality of the succinate dehydrogenase (SDH) complex, and mitochondrial-derived ROS. These assays are meant to be performed on cultured mammalian cells, although many can be adapted to study mitochondrial functions in vivo. Notably, the assays described in this protocol are more direct measurements of mitochondrial functions than the OCR. Moreover, they enable the measurement of mitochondrial function in hypoxia, a context in which the OCR is not an indicative measurement. Taken together, these assays, in combination with classical respirometry experiments, will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in mammalian cells.

저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

Our research focuses on how mitochondria sense and adapt to metabolic stressors. One key metabolic stressor is hypoxia, which occurs when cells are starved of oxygen. We are developing better assays to study mitochondrial function in low-oxygen environments.Higher resolution mass spectrometry was employed to study cell and tissue metabolite levels. We used stable isotope tracing studies to track the fate of specific metabolites and uncover novel metabolic pathways relevant to healthy and diseased mammalian physiology. Group has found that mammalian mitochondria can sustain critical functions in low-oxygen environments.Mechanistically, they employ fumarate as an alternative electronic scepter for the electron transport chain. This protocol compiles several assays that researchers can use to better assess mitochondrial function in mammalian cells. Importantly, these protocols can be used to study mitochondrial function in hypoxia, as classical respirometry experiments will not be sufficient.

DHODH, 복합체 I 및 복합체 V의 활성은 모두 증식 분석을 사용하여 평가할 수 있습니다. 배양 배지에서 우리딘이 제거되면 세포는 피리미딘 생합성을 위한 새로운 경로에 더 의존하게 됩니다. 따라서, 세포가 우리딘이 없는 배지에서 증식하도록 도전을 받았을 때, 그들은 우리딘을 함유한 배지에서 배양된 세포보다 브레퀴나에 의한 DHODH 활성의 억제에 더 민감하였다(도 6A). 유사하게, 배양 배지로부터의 피루브산의 박탈은 세포를 증식을 위한 복합체 I 활성에 더 의존하게 만든다. 따라서, 세포가 피루브산이 없는 배지에서 증식하도록 도전을 받았을 때, 그들은 피루브산-함유 배지에서 배양된 세포보다 로테논에 의한 복합체 I 활성의 억제에 더 민감하였다(도 6B). 복합체 V 활성은 포도당 대신 갈락토오스를 함유하는 배지에서 증식하도록 세포에 도전함으로써 평가할 수 있습니다. 갈락토오스는 해당과정에서 순 제로 ATP를 생성하므로 이 연료에서 성장하는 세포는 복잡한 V 활성을 통한 미토콘드리아 ATP 합성에 더 의존합니다. 따라서, 갈락토오스-함유 배지에서 증식하는 세포는 글루코스-함유 배지에서 증식하는 세포보다 올리고마이신에 의한 복합체 V 억제에 더 민감하였다 (도 6C).
SDH 활성은 13C5-글루타민 추적을 사용하고 푸마르산염 및 숙신산 동위원소로의 결합을 모니터링하여 측정할 수 있습니다. 비히클-처리된 조건에서, SDH 복합체는 순방향 활성을 선호하였고, 13C4-푸마레이트 내로의 13C4-석시네이트의 혼입은 13C3-석시네이트 내로의 혼입보다 더 높았다 (도 7). 항마이신 처리 조건에서, SDH 복합체는 역활성을 선호했고, 13C3-석시네이트로의 13C3-푸마르산염의 혼입은 13C4-석시네이트를 13C4-푸마르산염으로의 혼입보다 더 컸다(도 7).
미토콘드리아 내부의 슈퍼옥사이드 생성은 슈퍼옥사이드와의 반응 시 2-하이드록시미토에티듐을 생성하는 형광 리포터 MitoSox를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 연구에서, tertbutyl hydrogen peroxide의 존재 하에서 MitoSox로 처리 된 세포는 세포 ROS를 소멸시키는 항산화 제 인 NAC의 첨가에 의해 억제되는 방식으로 2- 하이드 록시 - 미토에 티듐 (2- hydroxy-mitoethidium)의 수치가 더 높았다 (그림 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> 그림 1: 복잡한 V 증식 분석에 대한 기계론적 기초. 해당과정을 통한 포도당과 갈락토오스의 산화. 포도당은 해당 과정에서 순 2 개의 ATP를 생성하는 반면, 갈락토오스는 UTP 합성이 UDP- 갈락토오스에 필요하기 때문에 순 제로 ATP를 산출합니다. 따라서 갈락토오스에서 성장한 세포는 해당과정에서 생성된 ATP가 부족하기 때문에 미토콘드리아 ATP 합성에 더 의존합니다. 약어: GALK = 갈락토키나제; GALT = 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제; PGM1 = 포스포글루코뮤타제 1; GPI = 포도당-6-포스페이트 이성질화효소, UGP = UDP-글루코스 피로포스포릴라제; GALE = UDP-갈락토오스-4-에피머라제; NDK = 뉴클레오티드 디포스페이트 키나아제; UMPK = 우리딘 모노포스페이트 키나아제; HK = 헥소키나제; PFK = 포스포프럭토키나제; 알도 = 알돌라아제; TPI = 트리오오스포스페이트 이성질화효소; GAPDH = 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소; PGK = 포스포글리세레이트 키나아제; PGM = 포스포글루코뮤타제; ENO = 에놀라아제; PK = 피루브산 키나아제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> 그림 2: 복합체 I 증식 분석에 대한 기계론적 기초. 복합체 I 활성의 억제에 따라 변경되는 대사 경로의 개략도. 고-피루브산 매질에서, 복합체 I 억제는 LDH-매개 NADH 산화를 통해 우회된다. 저 피루브산 배지에서 이러한 적응은 실현 가능성이 낮아 세포가 NADH를 재산화하기 위해 복합체 I 활성에 더 의존하게 만듭니다. 약어: LDH = 젖산 탈수소효소; TCA 사이클 = 트리카르복실산 사이클. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> 그림 3: 13C4-아스파르테이트 추적에 따른 DHODH 반응의 개략도. Brequinar는 디히드로로테이트 산화가 오로테이트로 산화되는 것을 억제하여 UMP의 다운스트림 합성을 방지합니다. 13C4-아스파르테이트는 DHODH 활성을 통해 13C3-UMP에 혼입된다. 약어: OMM = 외부 미토콘드리아 막; IMM = 내부 미토콘드리아 막; DHODH = 디히드로오로테이트 탈수소효소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> 그림 4: 13C5-글루타민 추적을 통한 정방향 및 역방향 복합체 II 활성 측정. 순방향 콤플렉스 II 활성을 측정하기 위해(왼쪽), 13C5-글루타민을 13C4-숙시네이트 및 13C4-푸마레이트로 혼입시키는 것을 모니터링합니다. 역 복합체 II 활성을 측정하기 위해(오른쪽), 13C5-글루타민을 13C3-숙시네이트 및 13C3-푸마레이트에 혼입시키는 것을 모니터링합니다. 약어: SDH = 숙시네이트 탈수소효소; CytC = 시토크롬 C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> 그림 5: MitoSox Red와 과산화물의 반응. MitoSox와 미토콘드리아 과산화물의 반응은 2-OH-MitoE2+를 형성합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> 그림 6: 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 증식 기반 분석 법 (A) ±100ug/mL 우리딘이 함유된 배지에서 DHODH 억제제인 5uM 브레키나로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. (B) ±5 mM 피루브산으로 배지에서 복합체 I 억제제인 2 uM 로테논으로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. (C) 10mM 포도당 또는 10mM 갈락토오스를 유일한 중심 탄소원으로 하는 배지에서 복합체 V 억제제인 5uM 올리고마이신으로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. *는 Graphpad Prism에서 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용한 p < 0.05를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> 그림 7: 복합체 II 활성을 측정하기 위한 13개의 C5-글루타민 추적. DMSO 및 500 nM 안티마이신 A-처리된 Caki1 및 DLD1 세포에서의 숙신산 산화 및 푸마레이트 환원(SDH 역방향). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 조건당 N = 3. GraphPad Prism에서 unpaired t-검정을 사용하여 p < 0.05를 나타냅니다. 약어: SDH = 숙신산 산화; SDH 역방향 = 푸마레이트 환원. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> 그림 8: 과산화물을 검출하기 위한 LCMS 기반 MitoSox 분석. Nac tBuOOH의 존재 하에 30분 동안 MitoSox로 처리된 Caki1 세포로부터 분리된 2-OH-Mito E2+ 의 추출된 이온 크로마토그램±. 약어: LCMS = 액체 크로마토그래피-질량 분석법; NAC = N- 아세틸 시스테인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 프로토콜에 사용된 시약, 완충액 및 배지의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

우리의 연구는 미토콘드리아가 대사 스트레스 요인을 감지하고 적응하는 방법에 중점을 둡니다. 주요 대사 스트레스 요인 중 하나는 세포에 산소가 부족할 때 발생하는 저산소증입니다. 우리는 저산소 환경에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 더 나은 분석법을 개발하고 있습니다.세포 및 조직 대사 산물 수준을 연구하기 위해 고해상도 질량 분석법이 사용되었습니다. 우리는 안정 동위원소 추적 연구를 사용하여 특정 대사 산물의 운명을 추적하고 건강하고 병든 포유류 생리학과 관련된 새로운 대사 경로를 밝혔습니다. 그룹은 포유류 미토콘드리아가 저산소 환경에서 중요한 기능을 유지할 수 있음을 발견했습니다.기계적으로, 그들은 전자 수송 사슬의 대체 전자 홀로 푸마르산염을 사용합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 더 잘 평가하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 분석을 컴파일합니다. 중요하게도, 이러한 프로토콜은 저산소증에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 사용될 수 있습니다., 고전적인 호흡 측정 실험으로는 충분하지 않기 때문입니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

1.7K 조회수.  University of Massachusetts Chan Medical School. 우리의 연구는 미토콘드리아가 대사 스트레스 요인을 감지하고 적응하는 방법에 중점을 둡니다. 주요 대사 스트레스 요인 중 하나는 세포에 산소가 부족할 때 발생하는 저산소증입니다. 우리는 저산소 환경에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 더 나은 분석법을 개발하고 있습니다.세포 및 조직 대사 산물 수준을 연구하기 위해 고해상도 질량 분석법이 사용되었습?...

비디오: 저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

연구

생화학

13C4-Aspartate and 13C5-Glutamine Stable Isotope Tracing, LC-MS Analysis, and SDH Activity Measurement

13C4-Aspartate and 13C5-Glutamine Stable Isotope Tracing, LC-MS Analysis, and SDH Activity Measurement  

To begin, seed the 143B human osteosarcoma cells in a six-well plate. Once cells become 75%confluent, replace the medium in each well with the medium containing 10 millimolar 13C4 aspartate, and incubate for eight hours to achieve a steady state for labeling the cells. For isolating metabolites, cool the prepared buffer overnight at minus 80 degrees Celsius or place it on dry ice.Meanwhile, take a plate from the incubator and aspirate the medium from each well using a pipette. Wash it with PBS twice, and then remove the residual PBS before proceeding further. Now place the plate on dry ice and add 800 microliters of prepared buffer to each well.To facilitate cell lysis, incubate the plate for 15 minutes at minus 80 degrees Celsius. After incubation, scrape each well on dry ice using a cell lifter, and transfer the lysate to a 15 milliliter microcentrifuge tube placed on dry ice. Vortex the lysate for 10 minutes at four degrees Celsius, and centrifuge it at four degrees Celsius and 17, 000 g for 10 minutes.Then transfer the supernatant to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube and dry it in a four degree Celsius vacuum concentrator with a cold trap under a high vacuum for approximately six hours. Store the dried metabolite pellet at minus 80 degrees Celsius until further use. For analyzing the sample using liquid chromatography mass spectrometry or LCMS, add 100 microliters of HPLC grade water to the dried pellet and vortex as demonstrated.Centrifuge the samples at four degrees Celsius for 10 minutes at maximum speed. Then transfer 25 microliters of supernatant to the LCMS vial, and inject two microliters into the LCMS system. To perform liquid chromatography, use a constant flow rate of 0.15 milliliter per minute, under the gradient mode of a mobile phase B from 80 to 20%for 20 minutes, 20 to 80%for 0.5 minutes, and hold at 80%for 7.5 minutes against mobile phase A.Next, perform mass spectroscopy by choosing a full scan between mz 70 to 1, 000 dalton.And resolution at 70, 000. Set AGC target of one times 10 to the sixth, and a maximum injection time of 20 milliseconds. Next, set the runtime to 16.5 minutes.Polarity set to positive. AGC target set to one to the power of five. Maximum IT set to 20 milliseconds.And scan range set to 70 to 1, 000 mass-to-charge ratio. Then set the spray voltage at 3.0 kilovolts. And the heated capillary at 275 degrees Celsius.Select the sheath gas flow at 40 units, the auxiliary gas flow at 15 units, and the sweep gas flow at one unit. For 13C5 glutamine isotope tracing, once the cells reach 75%confluency, change the medium to two millimolar 13C5 glutamine-containing medium, and incubate to achieve a steady state of labeling the cells of interest. Isolate and analyze the metabolites as previously demonstrated.After isolating and analyzing the metabolites, analyze the succinate dehydrogenase or SDH activity by calculating the percent labeling of 13C3 fumarate, 13C4 fumarate, 13C3 succinate, and 13C4 succinate. Then evaluate succinate oxidation and fumarate reduction using the formula. In vehicle-treated conditions, the SDH complex favored the forward activity, and the incorporation of 13C4 succinate into 13C4 fumarate was higher than 13C3 fumarate into 13C3 succinate.In antimycin-treated osteosarcoma cells, the SDH complex favored the reverse activity, and the incorporation of 13C3 fumarate into 13C3 succinate was more significant than 13C4 succinate into 13C4 fumarate.