먼저, 배양된 iPSC를 Dulbecco의 PBS 또는 DPBS로 세척한다. 그리고 1 밀리리터의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 혼합물을 첨가한다. 접시를 섭씨 37도에서 2 분 동안 배양하여 세포를 분리합니다.
다음으로, 1.5 밀리리터의 예열 된 iPSC 배양 배지를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 세포 배양 접시에서 세포를 7-10회 위아래로 피펫팅하여 해리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
세포를 실온에서 5분 동안 200xg로 펠렛화합니다. 그리고 상청액을 흡인합니다. 50 마이크로몰 Y27632로 보충된 iPSC 배양 배지 2밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다.
이제 10마이크로리터의 세포 현탁액을 사용하여 Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 50 마이크로몰 Y27632로 보충된 iPSC 배양 배지를 사용하여 세포 현탁액의 농도를 150 마이크로리터당 9, 000 세포로 조정한다. 배아체 또는 EB를 생성하려면 세포 현탁액 튜브를 흔들어 세포 침전을 방지한 후 150마이크로리터의 세포 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다.
가습된 분위기에서 48시간 동안 EB를 배양합니다. 배양이 끝나면 웰 당 100 마이크로 리터의 배지를 제거합니다. 그리고 Y27632없이 예열 된 신선한 배지 150 마이크로 리터를 추가하십시오.
종이로 덮인 면이 위를 향하도록 하여 0.2밀리리터 튜브 랙에 파라필름 그리드를 배치하여 파라필름에 4x4 딤플 그리드를 만듭니다. 그리고 장갑을 낀 손가락으로 각 랙 구멍을 부드럽게 눌러 EB를 기저막 매트릭스에 삽입합니다. 그런 다음 종이를 제거하고 가위를 사용하여 파라필름 사각형에서 딤플 격자를 잘라내어 60밀리리터 세포 배양 접시에 맞게 크기를 조정합니다.
딤플 파라필름을 0.2밀리리터 튜브 랙에 다시 놓아 기저막 매트릭스 액적 생성을 위한 기초를 제공합니다. 절단된 200마이크로리터 피펫 팁이 있는 피펫을 사용하여 배양 접시의 웰에서 파라필름 딤플로 EB를 차례로 조심스럽게 옮깁니다. 16개의 EB를 그리드로 이동한 후 새 200마이크로리터 피펫 팁을 가져와서 딤플에서 나머지 배지를 제거합니다.
이제 하나의 EB가 들어 있는 각 딤플에 기저막 매트릭스 한 방울을 피펫팅합니다. 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 액적 경계를 방해하지 않고 EB를 각 액적의 중앙으로 빠르게 이동합니다. 기저막 매트릭스 방울이 있는 딤플 파라필름을 60mm 세포 배양 접시에 넣습니다. 섭씨 37도에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션하여 매트릭스가 중합될 수 있도록 한다.
또한, 파라필름으로부터 매트릭스 내장 EB를 분리하기 위해, 비타민 A가 없는 분화 배지 5밀리리터를 접시에 첨가한다. 그리고 집게를 사용하여 파라필름 사각형을 거꾸로 뒤집어 EB가 있는 면이 접시 바닥을 향하도록 합니다. 접시를 조심스럽게 흔들어 파라필름에서 EB가 들어 있는 기저막 매트릭스 방울을 분리합니다.
그들 중 일부가 여전히 붙어 있으면 집게를 사용하여 파라필름 사각형의 가장자리를 잡고 접시 중앙을 향해 여러 번 빠르게 굴립니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 95%의 공기가 있는 가습 대기에서 55rpm의 궤도 오가노이드에서 대뇌 오가노이드를 배양합니다. 비타민 A 없이 DM에 오가노이드를 보관하고 격일로 배지를 교체합니다.
말초에 심실과 같은 구조와 작고 건강한 형태를 가진 파종 후 32일 인간 대뇌 오가노이드의 명시야 이미지가 표시됩니다.
