대조군 및 관심 유전자를 위한 충분한 양의 전기천공 혼합물을 준비하는 것으로 시작합니다. 페트리 접시 전극 챔버를 전기 처리기에 연결합니다. 그런 다음 Microloader 팁을 사용하여 미세 주입 바늘에 각 전기 천공 혼합물 8마이크로리터를 채웁니다.
미세한 가위를 사용하여 안정적인 흐름을 얻기 위해 사용하기 전에 바늘 끝을 자릅니다. 팁이 뭉툭하고 넓으면 오가노이드가 심하게 손상될 수 있으므로 팁의 작은 부분만 제거해야 합니다. 현미경으로 매끄러운 경계와 눈에 보이는 심실과 같은 구조를 가진 5개의 대뇌 오가노이드를 선택하십시오.
그런 다음 1000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 예열된 DMEM/F-12가 들어 있는 35mm 세포 배양 접시로 옮깁니다. 이제 심실과 같은 구조의 벽을 통해 바늘을 조심스럽게 삽입하고 눈에 띄게 채워질 때까지 전기 천공 혼합물을 주입합니다. 파열을 방지하기 위해 심실과 같은 구조에 과도한 압력을 가하지 마십시오.
미세주입된 대뇌 오가노이드 1개를 소량의 DMEM/F-12와 함께 페트리 접시 전극실로 옮깁니다. 미세 주입된 심실과 같은 구조의 표면이 전기 천공기의 양극에 연결된 전극을 향하도록 오가노이드를 배열합니다. 이제 1초 간격으로 각각 50밀리초 동안 80볼트의 펄스 5개를 사용하여 대뇌 오가노이드를 하나씩 전기천공합니다.
비멸균 조건에서 미세주입 및 전기천공을 수행한 경우 층류 후드 아래에서 전기천공된 오가노이드를 예열된 DMEM/F-12로 채워진 새로운 35mm 세포 배양 접시로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 가습 분위기에서 55RPM의 궤도 셰이커에서 비타민 A와 함께 DM의 전기천공된 오가노이드를 배양합니다. 다음날, 전기천공 후, 기존의 도립 형광 현미경으로 성공적인 전기천공을 위해 대뇌 오가노이드를 확인합니다.
절단된 1000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 전기천공된 오가노이드를 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 초과 배지를 제거합니다. DPBS에 충분한 양의 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 파라 포름 알데히드를 흡인하십시오.
그런 다음 5밀리리터의 DPBS를 넣고 부드럽게 흔들어 DPBS를 흡인합니다. 오가노이드는 나중에 사용할 때까지 섭씨 4도의 DPBS에 보관하십시오. 전기천공 이틀 후, GFP 양성 세포는 거의 독점적으로 심실 영역에 국한되어 있고 Pax6에 대해 양성이며, 이는 이들 세포가 정점 전구체 또는 신생아 기저 전구체임을 나타냅니다.
10 일 후, GFP 양성 세포는 기저 부위에 국한됩니다. 이 세포는 또한 Pax6 또는 NeuN에 대해 양성이며, 이는 각각 기저 전구체 또는 뉴런을 나타냅니다. GFP 양성 세포의 3차원 분포의 인상을 얻기 위해 전기천공된 대뇌 오가노이드의 3차원 재구성이 도시되어 있다.
