제조업체의 지침에 따라 실험을 시작하기 최소 2시간 전에 고압 냉동 또는 HPF 기계를 준비하십시오. 유형 A HPF 알루미늄 캐리어를 1 밀리리터 에탄올이 들어있는 2 밀리미터 원심 분리기 튜브로 옮기고 초음파 세척기에서 10 분 동안 초음파 처리합니다. 질적 여과지로 덮인 페트리 접시에서 캐리어를 건조시킵니다.
사전 세척된 캐리어를 1-헥사데센에 담그십시오. 미세 핀셋을 사용하여 HeLa 세포 배양 접시에서 미리 준비된 사파이어 디스크를 꺼냅니다. 정성적 여과지로 라벨이 붙은 표면을 만져 과도한 매체를 제거합니다.
사파이어 디스크를 HPF 시편 홀더에 장착하고 1-헥사데센이 포함된 0.025mm 깊이의 알루미늄 캐리어로 디스크를 빠르게 덮습니다. 정성적 여과지로 과잉 용액을 흡인합니다. 고압 동결을 위해 시편 홀더를 장착합니다.
액체 질소 하에서 사파이어 디스크 캐리어 어셈블리를 폼 극저온 상자에 넣습니다. 흄 후드의 20mm 원형 폴리프로필렌 용기에 동결 치환 고정 또는 FSF 용액 2밀리리터를 준비하고 액체 질소를 사용하여 동결합니다. 미리 냉각된 핀셋을 사용하여 사파이어 디스크와 캐리어 어셈블리를 액체 질소 하에서 냉동 FSF 용액과 함께 컨테이너에 넣습니다.
섭씨 영하 90도에서 FSF 처리를 위해 이 용기를 사전 냉각된 자동 동결 대체 기계 챔버로 옮깁니다. 표본을 섭씨 영하 90도에서 1시간 동안 유지한 다음 미리 냉각된 핀셋을 사용하여 캐리어에서 사파이어 디스크를 분리하여 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 합니다. 표본을 추가로 섭씨 영하 90도에서 8-10시간 동안 유지한 후 3시간 이내에 섭씨 영하 60도까지 예열합니다.
용기에 있는 FSF 용액 1개를 미리 냉각된 아세톤으로 교체하고 섭씨 영하 60도에서 1시간 동안 배양합니다. 이 아세톤 세척을 두 번 반복하십시오. 3 시간 이내에 섭씨 영하 30도까지 예열하십시오.
한편, 섭씨 영하 30도에서 2 밀리리터 원심 분리기 튜브에 2 밀리리터의 FSF 용액 2를 준비하고 사전 냉각하십시오. 아세톤을 FSF 용액 2로 교체하고 섭씨 영하 30도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용기의 FSF 용액 2를 미리 냉각 된 아세톤으로 교체하고 섭씨 영하 30도에서 30 분 동안 배양합니다.
이 아세톤 세척을 두 번 반복하십시오. 2 시간 이내에 섭씨 영하 30도에서 4도 정도 따뜻하게합니다. 아세톤을 2 밀리리터의 0.2 몰 HEPES 완충액으로 교체하십시오.
완충액을 한 번 교체하고 실온 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
