레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 켜고 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓습니다. 이미지 시각화 및 획득을 위해 20X 대물 렌즈를 선택합니다. 컨포칼 소프트웨어에서 순차 스캔 모드를 선택하여 BODIPY 493/503과 DAPI 간의 혼선을 방지합니다.
그런 다음 488 나노미터 아르곤 레이저 라인을 사용하여 BODIPY 493/503 다이를 자극하고 405 나노미터 레이저 라인을 사용하여 DAPI 염색을 자극합니다. 방출 범위를 BODIPY의 경우 493 - 589 나노미터, DAPI의 경우 410 - 464 나노미터로 설정합니다. 그런 다음 프레임 크기, 스캔 속도 및 평균을 조정하여 12비트의 2배 비트 깊이, 양방향의 방향, 스캔 영역 디지털 줌에서 1을 뺀 값, 핀홀에서 1을 뺀 영역 단위를 포함하는 평균을 구성합니다.
게인 및 디지털 게인 설정을 조정합니다. 범위 표시기에 표시된 대로 포화 픽셀이 없는지 확인하십시오. 지질 방울을 정확하게 식별한 후 BODIPY 및 DAPI 채널로 이미지를 획득합니다.
광역 이미지를 만들려면 10X 주관 렌즈로 전환하십시오. 그런 다음 타일 스캔 모드를 활성화하고 5x5 모자이크 이미지를 생성하도록 구성합니다. 3D 및 직교 뷰를 생성하려면 커버 유리 상단에 이멀젼 오일 한 방울을 바르고 대물 렌즈를 40X 렌즈로 변경합니다.
Z 스택 모드를 선택합니다. Z 평면을 조정하여 이미지 캡처를 위한 첫 번째 및 마지막 위치를 정의하고 초점이 맞춰진 모든 물방울을 캡처하기 위해 약 0.5미크론의 광학 슬라이스 두께를 보장합니다. 직교 모듈을 선택하고 직교 뷰를 생성합니다.
투명 렌더링 모드에 따라 3D 모듈을 선택하여 3D 이미지를 수집합니다. 영상 획득 후 CellProfiler를 사용하여 단면 영상 처리 및 분석을 시작합니다. CellProfiler 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 이미지 모드를 클릭하여 TIF 형식의 이미지를 업로드합니다.
names and types 모듈을 사용하여 파일 이름을 기준으로 BODIPY 방울과 DAPI 핵 염색 이미지를 정렬합니다. 지질 액적 분석의 경우 BODIPY 염색 이미지만 사용합니다. 모듈 조정을 클릭하여 파이프라인 구성을 시작하고 색상을 회색으로 모듈 선택하여 이미지를 그레이 스케일로 변환합니다.
그런 다음 기본 객체 식별 모듈을 사용하여 6에서 300 픽셀 사이의 지질 방울과 1의 임계 보정 계수를 정의하여 그레이 스케일 이미지 내에서 지질 방울을 감지합니다. 식별된 지질 방울의 픽셀 강도를 측정하려면 측정 객체 강도 모듈을 추가합니다. 추가 필터 개체 모듈을 통합하여 가장 강한 신호만 정량화하고 덜 강한 신호는 최종 지질 액적 분석에서 제외하도록 합니다.
다음으로, 출력 데이터와 관련된 지질 방울을 측정하려면 측정 개체 크기 형상 모듈을 추가합니다. 그런 다음 오버레이 윤곽선 모듈을 추가하여 식별된 물방울을 원본 이미지에 오버레이하여 분할이 처리되지 않은 이미지에서도 정확하게 보이도록 합니다. 완료되면 스프레드시트로 내보내기 모듈을 추가하고 왼쪽 하단 모서리에서 이미지 분석 버튼을 클릭합니다.
대조군과 비교하여 HFD를 먹인 동물은 뚜렷한 이상지질혈증 프로필과 순환 트리글리세리드 수치의 미묘한 증가를 나타냈습니다. 광역 이미지는 HFD를 먹인 동물의 간에서 증가된 지질 방울을 보여주었습니다. CellProfiler를 사용한 분석 결과 간 지질 방울의 수가 증가하고, BODIPY 형광 강도가 증가하고, 면적 비율이 360%이며, 직경이 더 커진 것으로 나타났습니다.
HFD를 먹인 동물의 크기 분포는 9 미크론 이상의 거대 소포 간 지질 방울의 증가와 3 미크론 미만의 미세 소포의 감소를 나타냈다.
