시작하려면 2 밀리리터의 4 % 포르말린 또는 기타 적절한 고정제를 준비하십시오. 또한 절차를 시작하기 전에 페트리 접시, 집게 및 수술용 가위를 준비하십시오. 적절하게 안락사된 냉동 다친 물고기를 탈이온수가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
가위를 사용하여 꼬리 꽃자루의 앞뒤에서 몸을 자릅니다. 페트리 접시 내부의 탈이온수에서 조직이 흘러나오도록 합니다. 집게를 사용하여 꼬리 꽃자루를 모아 미세 원심 분리기 튜브에 준비된 고정 용액으로 옮깁니다.
튜브를 조심스럽게 여러 번 뒤집습니다. 장착하기 전에 고정 조직을 PBS로 로커에서 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도로 미리 냉각된 탈이온수에 30% 자당 용액이 들어 있는 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집습니다.
튜브를 섭씨 4도에서 최소 24시간 동안 똑바로 세워 두십시오. 임베딩 몰드를 5mm 층의 OCT 마운팅 미디어로 채웁니다. 집게를 사용하여 꼬리 꽃자루를 금형 바닥에 놓습니다.
횡단면 또는 관상단면의 방향을 조정합니다. 매체를 드라이 아이스 상자에서 얼리십시오. 조직이 원하는 위치에서 안정화 되 자마자 OCT가 완전히 얼기 전에 나머지 금형을 채 웁니다.
저온 유지 장치를 사용하여 조직을 절단하기 전에 금형을 섭씨 80도에서 최소 1시간 동안 보관하십시오. 냉동 손상 후 다른 날의 냉동 손상 정도(DPCI)는 Aniline Blue, Acid Fussin 및 Orange-G로 구성된 삼색 염색을 사용하여 꼬리 꽃자루 섹션에서 분석되었습니다. 손상된 부위는 주황색 얼룩이 없어서 결정되었습니다.
4 및 7 dpci에서 횡단면은 신체의 극저온 손상된 측면에서 광범위하게 퇴행된 골격근을 나타냈습니다. 면역형광 분석에 따르면 4 DPCI에서 꼬리 꽃자루의 손상된 쪽에는 DAPI 양성 세포가 풍부했지만 F-액틴과 트로포미오신 1은 거의 또는 전혀 포함되어 있지 않아 퇴행성 근육을 나타냅니다. 7 dpci에서 tropomyosin 1과 F-actin은 수직 몸체 정중선에 가까운 상처에서 검출 될 수 있었으며, 이는 새로운 근 섬유 형성의 시작을 나타냅니다.
30dpci에서 신체의 양쪽은 유사한 F-액틴 염색 분포를 나타내어 효율적인 골격근 복원을 나타냅니다.
