시작하려면 동기화된 젊은 성인 C.Elegans 자웅동체를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. Poloxamer 188, Pluronic F127 및 염색 키트 시약 2마이크로리터를 포함하는 M9 완충액 200마이크로리터를 웜 펠릿에 추가합니다. 염료를 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮으십시오.
혼합물을 실온에서 1시간 동안 20RPM으로 회전시킵니다. 그런 다음 500G에서 1분 동안 웜을 회전시킵니다. 그 후, 웜 펠릿을 방해하지 않고 염색 용액을 제거하십시오.
M9 완충액으로 벌레를 세 번 세척하고 적절한 처리가 포함된 시드된 NGM 한천 플레이트로 옮깁니다. 플레이트에서 벌레를 1밀리리터의 M9 버퍼가 있는 신선한 마이크로 원심분리기 튜브로 세척합니다. 그런 다음 1% 포름알데히드로 벌레를 얼음에 30분 동안 고정시킵니다.
그리고 1밀리리터의 M9 완충액으로 벌레를 세 번 세척하여 잔류 포름알데히드를 제거합니다. 웜을 펠렛화 한 후, 최대량의 상청액을 흡인하여 펠릿을 10 마이크로 리터의 M9에 그대로 유지합니다. 다음으로, 2.5% 아가로스를 제조하기 위해, 0.125 그램의 아가로스를 10 밀리리터의 붕규산 유리 시험관에 칭량한다. 5 밀리리터의 M9 완충액을 첨가하고 분젠 버너로 튜브를 부드럽게 가열하여 아가로스를 용해시킨다.
용융된 용란을 섭씨 75도로 설정된 건조 수조로 옮깁니다. 100 마이크로리터의 용융된 아가로스를 1 밀리리터 팁을 사용하여 데크 글로서 현미경 커버 글라스 상에 첨가한다. 즉시, 다른 슬라이드를 아가로스 방울에 수직으로 놓아 십자형을 형성한다.
2분 후, 상부 커버 유리를 밀어 슬라이드를 부드럽게 분리하고, 아가로스 패드를 하단 커버 슬라이드에 남겨둔다. 파스퇴르 유리 피펫으로 벌레를 아가로스 패드로 옮깁니다. 실험실 물티슈로 만든 심지를 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오.
그런 다음 더 작은 커버 슬립으로 벌레를 덮고 증발을 방지하기 위해 주변에 투명 매니큐어를 바르십시오. 슬라이드를 빛으로부터 보호하기 위해 어두운 상자에 넣으십시오. 컨포칼 현미경을 사용하여 60배 배율 렌즈를 사용하여 적절한 파장에서 24시간 이내에 벌레를 이미지화합니다.
그런 다음 이미징 소프트웨어를 열고 회색 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 표시되는 팝업에서 획득을 선택합니다. Ti2 풀 패드.
ND 획득 및 조회 테이블. Ti2 전체 패드에서 60번을 선택하고 현미경 미세 초점 노브를 조정하여 웜에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 회전 디스크를 선택하고 16비트 비닝 없음 옵션을 선택합니다.
각 형광 필터에 대해 노출 시간을 500밀리초로 설정하고 명시야의 경우 20밀리초로 설정합니다. 이러한 매개 변수가 설정되면 지금 실행을 선택하고 출력 이미지가 ND2 파일로 생성될 때까지 기다립니다.
