Isolation and Normalization of DNA Containing Crosslinked Proteins

DNA 함유 가교 단백질의 분리 및 정상화를 시작하려면 유비퀴틸화 및 SUMOylation 약물 처리 후 흡입 피펫을 사용하여 배지를 흡인합니다. 600마이크로리터의 DNAzol 시약을 첨가하기 전에 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 헹굽니다. 섭씨 4도에서 10 분 동안 진동 플랫폼에서 플레이트를 천천히 교반하고 0.3 밀리리터의 100 % 차가운 에탄올을 플레이트에 직접 첨가합니다.

불투명한 핵산 응집체가 보일 때까지 교반을 반복합니다. 다음으로, 세포 용해물을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 20, 000 G에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리합니다.상청액을 흡인 한 후 핵산과 가교 단백질 펠렛을 75 % 에탄올 1 밀리리터로 세척 한 다음 20, 000 G 및 섭씨 4도에서 2 분간 원심 분리합니다. 동일한 속도로 회전하고 P-20 피펫을 사용하여 남은 액체를 제거하기 전에 상청액을 흡인합니다.

펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. 건조된 핵산 펠릿을 0.1 밀리리터의 이중 증류수에 용해시키면서 위아래로 몇 번 피펫팅한다. 그런 다음 펠릿이 적어도 세 번 부풀어 오를 때까지 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 현탁액을 배양합니다.

30% 진폭의 초음파 프로세서 프로브를 사용하여 10초 동안 샘플을 초음파 처리하고 UV-Vis 분광계를 사용하여 DNA 농도를 정량화합니다. 이중 증류수를 첨가하여 DNA의 농도를 120 마이크로 리터에서 마이크로 리터당 400-500 나노 그램으로 조정하십시오. 그런 다음 20마이크로리터의 샘플을 소화되지 않은 DNA 로딩 대조군으로 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.

2, 000 겔 단위의 미세 구균 뉴 클레아제와 11 마이크로 리터의 10X 칼슘 미세 구균 뉴 클레아 제 반응 완충액을 DNA에 첨가하고 나머지 100 마이크로 리터의 이중 증류수에 용해시킨다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.