Western Blotting of Digested DNA Samples Containing DNA-Protein Crosslinks (DPCs)

정규화된 소화된 DNA 샘플의 웨스턴 블로팅을 시작하려면 4X Laemmli 샘플 버퍼를 추가하고 샘플을 5분 동안 끓입니다. 5 내지 6 마이크로그램의 소화된 샘플을 4 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, SDS-PAGE를 수행하여 변형되지 않은 변형 및 번역 후 변형 또는 PMT 복합 DPC를 분해한다.

이미지 획득 전에 이중 증류수로 겔을 2시간 동안 세척합니다. 유비퀴틸화, SUMO-1 또는 SUMO-2 및 3 변형, ADP 리보실화, 총 TOP1, TOP2 알파 또는 TOP2 베타 DPC를 검출하기 위해, 표에 나타낸 바와 같이 상응하는 항체를 희석한다. 다음으로, 1차 항체의 적절한 희석액으로 겔을 블로킹 완충액에 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 멤브레인을 배양합니다.

일단 완료되면 PBST 세척 멤브레인을 실온에서 60분 동안 블로킹 버퍼에 5, 000배 희석한 2차 항체로 인큐베이션한 후 강화된 화학발광 시약으로 멤브레인을 현상합니다. 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다. 캄프토테신 노출은 TOP1 DPC 형성을 유도했습니다.

TOP1 DPC 형성은 항-SUMO-2 및 3 변형과 유사한 캄프토테신 노출 20분 후에 최고조에 달했습니다. SUMO-1 변형 및 유비퀴틸화의 정점이 또한 관찰되었다. DPC와 SUMO-2 및 3 TOP1 변형은 캄프토테신 용량 의존적 방식으로 감소했습니다.

지방세포-유도된 TOP2 DPCs 및 SUMO-2 및 3 변형은 20분에 피크에 도달한 후 감소하였다. 이에 비해 SUMO-1 및 유비퀴틴 변형은 60분에 최고조에 달했습니다. 포름알데히드-유도된 DPCs 및 이들의 SUMO-2 및 3, SUMO-1, 및 유비퀴틸화는 용량 의존적 방식으로 형성 및 축적된다.

항-PAR 항체를 사용한 TOP1 DPC의 PARylation의 정량적 검출, PARG 억제제가 세포에 첨가되지 않는 한 PARylation은 검출할 수 없었으며, 이는 PARylation이 신속하게 발생하고 매우 동적임을 시사합니다.