먼저, 소화 및 확장된 보관 또는 신선한 임상 조직 샘플을 채취하여 6웰 세포 배양 플레이트의 단일 웰에 넣어 항체 염색을 진행합니다. 시료를 PBS로 실온에서 각각 10분씩 3회 세척한다. 샘플 크기에 따라 염색 완충액에 1차 항체 0.5-2밀리리터를 첨가하여 겔을 적절하게 덮습니다.
섭씨 37도에서 하룻밤 배양합니다. 그 후, 시료를 PBS로 실온에서 각각 10분씩 3회 세척하였다. 상응하는 2차 항체를 첨가하고 선택한 염색 완충액에서 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다.
앞에서 설명한 대로 샘플을 다시 세척하고 1-2밀리리터의 폴리에틸렌 글리콜을 6웰 플레이트의 샘플에 추가합니다. 실온에서 3시간 동안 Fluor 4 공액 NHS 에스테르로 샘플을 염색합니다. 배양이 끝나면 샘플을 PBS로 세 번 세척합니다.
다음으로, 지질 염색을 수행하기 위해 팽창 조직 시료를 취하여 PBS로 3회 세척하고, 0.1% Triton X-100 또는 PBS를 200ml에 200배 희석한 통상의 친유성 염료를 실온에서 72∼96시간 동안 도포하고, PBS로 3회 이상 세척한다. FISH를 수행하기 위해, 2 x SSC, 10% 덱스트란 설페이트, 20% 에틸렌 카보네이트, 및 0.1% 트윈 20을 조합하여 하이브리드화 완충액을 제조한다. 균질화된 겔 샘플을 섭씨 60도에서 30분 동안 예열된 하이브리드화 완충액에 넣습니다.
그런 다음 섭씨 45도에서 밤새 표적 유전자에 대해 10개의 피코몰 FISH 프로브를 포함하는 하이브리드화 완충액으로 겔 샘플을 배양합니다. 샘플을 섭씨 45도에서 각각 15분 동안 두 번, 섭씨 37도에서 10분 동안 두 번 엄격한 세척 완충액으로 세척합니다. PBS로 10분 동안 샘플을 3회 세척하고 섭씨 4도에서 PBS와 0.02% 아지드화나트륨에 샘플을 저장하거나 이미징을 진행합니다.
조직을 완전히 확장하고 이미지화하기 위해, PBS에서 4배 확장된 샘플을 유리 바닥 6웰 이미징 플레이트로 옮깁니다. 샘플이 더 확장되면 더 작은 조각으로 자릅니다. 유리 표면에 0.1% 폴리리신을 바릅니다.
샘플을 슬라이드에 놓고 종이 실험실 천으로 젤 주변의 과도한 액체를 제거하여 이미징 중 젤 이동을 방지합니다. 그런 다음 기존의 광시야 현미경, 컨포칼 현미경 또는 선택한 다른 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다. 이미징 후, PBS에서 샘플을 최소 3회의 10분 세척으로 축소하는데, 이는 탈이온수에 장기간 보관하면 형광 신호가 저하되기 때문입니다.
마지막으로 섭씨 4도에서 0.02% 아지드화나트륨이 함유된 PBS에 샘플을 보관합니다. 완전히 확장된 마우스 뇌 조직의 컨포칼 이미지를 통해 단백질과 세포 및 미토콘드리아 막 구조를 시각화할 수 있었습니다. 형식적이고 고정된 파라핀-포매된 인간 림프절 조직의 핵산이 또한 확인되었다.
신장 절편이 3.5배 확장된 후 균열이 없는 확장된 사구체가 보였습니다. 그러나 부적절한 고정 또는 균질화로 인해 균열, 왜곡 및 다른 신장 섹션에서 표지된 표적의 손실이 발생했습니다.
