12밀리리터의 DMEM에 200만 개의 pan02 세포를 접종하고 섭씨 37도, 습도 95%, 이산화탄소 5%, 공기 35%에서 배양합니다. 48시간 배양액을 28 g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 섭씨 4도에서 밤새 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 1밀리리터의 2.5%글루타르알데히드를 추가하여 세포를 고정합니다.
다음날 샘플을 1006g에서 5분 동안 원심분리하고 고정액을 흡인한 후 샘플을 0.1몰 PBS로 2회 헹굽니다. 이어서, 샘플을 이중 증류수로 각각 10분 동안 두 번 헹굽니다. 다음으로, 1 % 오스뮴 사산화 수소와 1.5 % 페로 시안화 칼륨의 50 마이크로 리터 용액을 1 : 1의 비율로 첨가하고 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양한다.
샘플을 0.1몰 PBS로 두 번, 이중 증류수로 한 번 원심분리하고 헹굽니다. 그런 다음 1 밀리리터의 1 % thiocarbohydrazide를 넣고 실온에서 30-60 분 동안 배양하십시오. 배양 후 원심분리하여 상층액을 버리고 시료를 이중 증류수로 4회 헹구었다.
다음으로, 50 마이크로 리터의 1 % 오스뮴 사산화물을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 고정시킨다. 다시 원심분리하고 이중 증류수로 샘플을 4회 헹굽니다. 1 밀리리터의 2 % 우라닐 아세테이트를 넣고 밤새 섭씨 4도에서 염색되도록합니다.
샘플을 이중 증류수로 헹구고 Walton 용액 1 밀리리터를 첨가하고 섭씨 60도에서 1 시간 동안 배양합니다. 배양 후 세포를 이중 증류수로 4회 헹구고 각각 10분 동안 등급화된 에탄올 시리즈로 탈수합니다. 그런 다음 100 % 아세톤 1 밀리리터에서 각각 10 분 동안 두 번 탈수하십시오.
다음으로, 200 마이크로리터의 아세톤과 Pon 812 에폭시 수지를 3:1, 1:1 및 1:3의 비율로 혼합한다. 그리고 샘플을 실온에서 각각 2, 4, 4시간 동안 수지에 담그고 각각 100%Pon 812 에폭시 수지에 샘플을 밤새 함침시킵니다. 다음날 시편을 평평한 매립 금형에 옮기고 섭씨 60도의 오븐에서 48시간 동안 중합합니다.
중합 후, 울트라 마이크로톰을 사용하여, 가수분해된 실리콘 웨이퍼에 70나노미터 두께의 연속적으로 슬라이스된 스트립을 수집하고, 이들을 섭씨 60도의 오븐에서 10분 동안 건조시킨다.
