Image Acquisition and Analysis for the Detection of Autophagy Protease ATG4B Using Luciferase Assay

현미경 작동 소프트웨어를 실행하여 시작하십시오. 설정 탭에서 올바른 사전 정의된 플레이트 유형을 선택합니다. eject를 눌러 플레이트에 접근합니다.tage 플레이트를 배치한 다음 load를 눌러 플레이트를 현미경에 로드합니다.

다음으로, 개구수가 0.4인 20배 공기 대물렌즈를 선택합니다. 선택한 플레이트 유형의 플레이트 두께에 맞게 20x 에어 대물렌즈의 보정환을 조정합니다. 채널 선택을 Hoechst 33342로 설정하고 Hoechst 채널에 대한 이미징 매개변수를 조정합니다.

플레이트 내에서 대표 웰을 선택하여 선택한 설정을 테스트합니다. 정의된 레이아웃에서 모든 플레이트 웰과 필드를 선택합니다. 그런 다음 온라인 작업에서 해당 폴더를 선택하여 데이터를 온라인 분석 소프트웨어로 전송합니다.

실험 설정이 저장됩니다. 실험 실행 탭에서 이미징할 플레이트의 이름이 지정되고 이미징 프로세스가 시작됩니다. 이미지 분석을 시작하려면 먼저 소프트웨어를 실행하고 분석할 이미지를 선택한 다음 이미지 분석 탭을 클릭하여 이미지 분할을 시작합니다.

그런 다음 입력 이미지 탭에서 더하기 기호를 클릭하여 새 빌딩 블록을 추가합니다. 목록에서 핵 찾기를 클릭합니다. 이미지에서 분할된 객체를 검사한 후 가장 적합한 분할 방법을 선택합니다.

분할 방법 내에서 검출 파라미터를 조정합니다. define results(결과 정의)를 클릭하고 표준 출력을 방법으로 선택합니다. 데이터베이스에 분석 저장(save analysis to database)을 클릭하여 분석 파이프라인을 저장합니다.

배치 분석(batch analysis) 탭에서 메서드(method) 옵션 아래에 표시될 저장된 파이프라인을 클릭합니다. 그런 다음 분석할 데이터를 선택합니다. 분석 시작을 클릭하여 분석을 시작하여 셀 번호에 대한 데이터 세트를 생성합니다.

설명된 세포 기반 분석은 ATG4B 활성의 변화를 간접적으로 반영하는 리포터 판독에 의존하여 ATG4B 활성의 억제제와 활성화제를 모두 검출할 수 있습니다. 세포 생존율에 대한 각 화합물의 ATG4B 활성의 비율은 ATG4B 억제제의 식별을 위한 컷오프 값으로 사용됩니다. 비율이 1보다 크면 ATG4B 활성제가 가능함을 나타내고 비율이 1보다 작으면 ATG4B 억제제가 가능함을 나타냅니다.