꿀벌을 2마이크로리터의 6xHis 태그 재조합 담배 에칭 바이러스 또는 TEV 프로테아제로 배양하여 크로마틴 단일 복제 유전자 자리를 정제하는 데 사용되는 자성 비드에서 lexA CBP 크로마틴 고리 복합체를 방출합니다. 마그네틱 랙 이송을 사용하여 최종 용출액에서 꿀벌을 분리한 후, 절단된 크로마틴 고리를 포함하는 용리액을 새로운 1.5밀리리터 반응 튜브로 옮깁니다. 다시 튜브를 마그네틱 랙에 올려 최종 용리액에서 잔류 비드를 분리합니다.
DNA 및 단백질 분석을 위해 일부 샘플을 섭씨 20도에 보관하기 전에 750마이크로리터의 차가운 탄산암모늄 완충액에 비드를 재현탁시킵니다. 최종 용리액에서 샘플을 꺼내 DNA 및 단백질 분석을 위해 섭씨 20도에서 보관합니다. 또한 잔류 비드에서 샘플을 채취합니다.
750 마이크로리터의 차가운 탄산암모늄 완충액에서 각각 20분 동안 분당 20회전으로 섭씨 4도에서 회전하여 마그네틱 비드를 두 번 세척하여 변성 용출을 시작합니다. 다음으로, 500 마이크로리터의 0.5몰 수산화암모늄을 비드에 첨가하여 결합된 lexA 염색질 복합체를 추출하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 현탁액에서 비드를 분리하고 용리액을 결합이 적은 반응 튜브로 옮깁니다.
저결합 반응 튜브를 실온에서 30분 동안 배양하고 마그네틱 랙을 사용하여 현탁액에서 비드를 분리합니다. 완료되면 용리액을 결합이 적은 반응 튜브로 옮깁니다. 750마이크로리터의 탈이온수에 비드를 재현탁시키고 DNA 및 단백질 분석을 위한 샘플을 수집합니다.
마지막으로, 최종 용리액에서 DNA 및 단백질 분석 샘플을 얻습니다. 이 연구에서는 ARS316 유전자좌의 정제 효율과 재조합 균주를 정량화하여 대조군 PDC1과 비교하였다. ARS316 유전자좌는 PDC1에 비해 플로우 스루의 회복률이 낮았습니다.
불완전한 TEV 프로테아제 절단으로 인해 염색질 고리의 일부가 TEV 비드에 결합되어 있었지만 변성 용출은 80-90%의 ARS316 유전자좌 회수를 가져왔습니다. 이는 정량화된 분획에서 ARS316 유전자좌의 농축을 나타내지 않은 대조군 균주와 비교하여 효모 게놈의 크기를 고려할 때 TEV 비드 및 변성 용출 분획에서 ARS316 분자의 높은 농축에 해당합니다. TEV 용출 후, TEV 절단 효율이 100%가 아니었기 때문에 비드는 ARS316 유전자좌의 회수율이 더 높았으며, 그 결과 비드에 결합된 염색질 고리의 일부가 남아 있었습니다.
그러나, 변성 용리는 효모 게놈의 크기를 고려할 때 ARS316 유전자좌의 80-90% 회수율과 ARS316 분자의 높은 농축에 해당하는 재조합 균주를 보여주었습니다.
