시작하려면 안락사 된 새끼 쥐에서 분리 한 뇌를 EBSS 및 2X PSN이 포함 된 차가운 MEM이 들어있는 3cm 페트리 접시에 넣으십시오. 해부 범위에서 뇌 반구를 분리하고 중뇌, 해마 및 수막을 제거하고 버립니다. 2X PSN이 있는 5밀리리터의 MEM EBSS가 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에 두 피질 반구를 넣고 얼음 위에 보관합니다.
조직 배양 후드에서 피펫을 사용하여 50밀리리터 원추형 튜브에서 배지를 흡입하고 피질 조직 조각은 바닥에 남겨둡니다. 코팅된 유리 피펫으로 예열된 해리 매체 10mL를 넣고 조직을 10-20회 삼각화합니다. 현탁액을 작은 젓는 막대가 있는 50밀리리터 비커로 옮기고 젓는 플레이트에 놓습니다.
그런 다음 비커를 제거하고 조직이 가라앉을 수 있도록 3분 동안 30도 각도로 놓고 세포 현탁액을 얼음 위의 새로운 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 50밀리리터 원뿔형 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 1000G로 원심분리합니다. 상층액을 신경교 성장 배지로 교체하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
10cm 세포 배양 처리된 접시에 세포를 100만 밀도로 플레이트하고 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 신선한 신경교 배지로 교체하고 세포가 실험을 위해 도금하기 전에 2주 이내에 100% 합류에 도달하도록 합니다. 플레이트 100, 6 웰 플레이트에서 웰 당 000 개의 신경 교세포 및 체외 프리온 감염에 대한 80 %to 100 % 합류에 도달 할 수 있습니다.
20% 희석된 뇌 균질화와 PBS를 자외선에 30분 동안 노출시킵니다. 감염될 신경교세포에서 배지를 흡인하고 웰당 0.1%의 정상 또는 프리온 뇌 균질액과 함께 1.5-2밀리리터의 신경교세포 성장 배지를 추가합니다. 72시간 후 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척한 다음 새로운 신경교세포 성장 배지를 추가합니다.
혈청학적 피펫을 사용하여 0.25%트립신 용액에 약 1ml의 HBSS에 있는 지방 조직을 조심스럽게 흡입합니다. Dnase-1, 콜라겐분해효소 및 Dispase 혼합물이 포함된 DMEM F-12 배지 2밀리리터가 들어 있는 4cm 페트리 접시에 조직을 옮깁니다. 그런 다음 가위를 사용하여 지방 조직을 작은 조각으로 자르고 혼합물을 섭씨 37도에서 1.5시간 동안 배양합니다.
조직을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 조직을 삼각체로 만들고 빨갛게 보이는 기질 혈관 분획을 펠릿으로 만듭니다. 멸균 PBS로 펠릿을 세척하고 3분 동안 원심분리한 후 펠릿을 1mL의 ADMSC 매체에 재현탁시킵니다. 그 후, 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 피펫팅하여 멸균된 50밀리리터 원추형 튜브에 넣어 해리되지 않은 조직을 제거합니다.
10cm 세포 배양 처리된 접시에 9ml의 ADMSC 배지를 추가합니다. 변형된 세포 현탁액을 피펫팅하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 다음날 매체를 바꾸고 80%to90%confluency를 달성하면 세포를 통과시킵니다.
세포가 2-3 개의 통과를 거친 후, 3-10 밀리리터의 배지에 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 계산합니다. 플레이트 100, ADMSC 배지를 포함하는 6 웰 플레이트에 웰 당 000 세포를 플레이트하고 앞서 표시된 것처럼 밤새 배양합니다. 다음 날, TNF-알파 밀리리터당 10나노그램 또는 IFN-감마 밀리리터당 200나노그램을 사용하여 사이토카인 자극 세포용 ADMSC 배지를 준비합니다.
대조군 샘플에 대해 최종 농도가 0.1%프리온에 감염되거나 정상적인 뇌 균질액인 ADMSC 배지를 생성합니다. 오래된 배지를 흡인하고 1.5mL의 사이토카인 또는 뇌 균질액 함유 배지를 해당 웰에 세 번에 걸쳐 추가한 다음 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 1% 베타-메르캅토에탄올이 포함된 350마이크로리터의 용해 완충액을 추가하여 RNA를 분리합니다.
세포 리프터를 사용하여 세포 용해물을 제거하고 샘플당 25나노그램의 RNA를 역전사하고 상보성 DNA를 증폭합니다. 50, 우물 당 000 세포 또는 100에 1 차적인 혼합된 아교세포에 BV2 microglia를 판을 판을 판으로 깔고, 6 우물 판에 있는 우물 당 000 세포. BV2 세포를 0.1%프리온에 감염된 배지 또는 정상 뇌가 포함된 배지로 처리하고 균질화하고 72시간 동안 배양합니다.
배양 후 PBS로 세포를 두 번 세척하여 남아 있는 뇌 균질액을 제거합니다. 세포에 새 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. ADMC를 자극하려면 BV2 또는 혼합 신경교세포와 함께 배양하기 전에 24시간 동안 TNF-알파 밀리리터당 10나노그램으로 처리합니다.
자극된 ADMC를 PBS로 세 번 세척하고 앞서 시연한 대로 ADMSC 현탁액을 회전시킵니다. BV2 세포 또는 혼합 신경교세포의 배지를 ADMSC 배지 웰당 2밀리리터로 교체하고, 공극 크기가 0.4마이크로미터인 6웰 플레이트용 인서트를 웰의 절반에 배치합니다. 각 인서트에 2ml의 ADMSC 매체를 추가하고 인서트를 받지 않는 웰에 2ml의 매체를 추가로 추가합니다.
펠릿화에, ADMCs를 현탁하고 세고, 50, 000에서 100, 각 삽입에 000의 세포를 추가하고 그(것)들을 잠복하십시오. 배양이 끝나면 인서트를 제거하고 버리거나 새 6웰 플레이트에 교체하고 PBS로 인서트를 두 번 세척합니다. RNA 분리 키트에서 제공하는 완충액을 혼합 신경교세포 또는 BV2 세포에 추가하고 웰을 긁어냅니다.
