대조군 및 에토포시드 처리된 배낭 또는 GV, 난모세포를 실온에서 40분 동안 PFA-Tx 100 완충액으로 다른 플라스틱 조직 배양 접시에 넣습니다. 실온에서 3개의 별개의 50마이크로리터 세척 완충액으로 난모세포를 헹구고 25마이크로리터의 차단 완충액에 1시간 동안 뜨거운 블록에 놓습니다. 다음으로, 감마 H2AX를 인식하는 1차 항체를 준비한다.
1차 항체를 차단 완충액으로 1:200 비율로 희석하고 밤새 섭씨 4도에서 15마이크로리터 방울에 난모세포를 담그십시오. 난모세포를 3개의 다른 50마이크로리터 세척 완충액으로 세척합니다. Alexa Fluor 488 접합 성장 항-토끼 2차 항체를 준비합니다.
차단 완충액으로 희석한 후 난모세포를 15마이크로리터의 항체 방울에 1시간 동안 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도의 고온 블록에 담근다. 원적외선 형광 DNA 염료 DRAQ7을 취하여 난모세포를 암실 실온에서 10분 동안 옮긴 후 3가지 다른 세척 완충액으로 세척합니다. 컨포칼 현미경 검사를 위해 35mm 유리 바닥 페트리 접시에 있는 난모세포에 세척 완충액을 작은 방울을 추가합니다.
레이저 컨트롤러와 공초점 시스템의 레이저를 켭니다. 현미경 컨트롤러와 램프를 켠 후 컨포칼 소프트웨어를 열고 40X 오일 렌즈를 선택합니다. 난모세포가 있는 접시를 검체 홀더에 넣고 조이스틱을 사용하여 X, Y, Z축의 스테이지를 움직여 난모세포에 초점을 맞춥니다.
포화를 최소화하기 위해 각 실험에 대해 레이저 출력, 게인 및 핀홀 크기를 독립적으로 설정합니다. 각 난모세포에 대해 DNA 영역의 핵에서 구체적으로 관심 영역을 설정합니다. DNA 영역의 경계를 정의하고 Z 스텝 크기를 3마이크로미터로 조정합니다.
그런 다음 스캔을 시작합니다. 선택한 폴더의 각 셀에 대한 이미지를 저장합니다. ImageJ 소프트웨어를 열고 이미지를 클릭한 다음 색상을 클릭하고 채널을 분할합니다.
모든 채널을 분할합니다. 조회 테이블을 클릭하고 각 채널에 대해 선호하는 색상을 선택하십시오. 이미지, 색상 및 병합 채널을 클릭하여 감마 H2AX 및 DNA 채널을 병합합니다. DNA 손상 수준이 높은 둘러싸인 핵소체 난모세포에서 이미지, 스택, Z-project를 클릭하고 자유형 선택 명령을 사용하여 전체 DNA 영역을 선택합니다.
analyze(분석)를 클릭한 다음 measure(측정)를 클릭하여 감마 H2AX 형광을 측정하고 측정값을 Excel 파일로 복사합니다. 에토포시드 처리 0시간 후 난모세포로 둘러싸인 GV 단계의 감마 H2AX 형광이 이 그림에 나와 있습니다. 감마 H2AX는 모든 에토포시드 농도에서 노출 직후에 증가하며 증가는 농도에 따라 다릅니다.
에토포시드 처리 20시간 후의 난모세포로 둘러싸인 GV 단계의 감마 H2AX 형광이 여기에 나타나 있다. 감마 H2AX는 모든 에토포시드 농도에서 노출 후 20시간 후에 감소합니다. 장기간의 전립선 정지 후, GV 단계 난모세포는 감마 H2AX 병소 수와 강도를 감소시키는 능력을 보여주었으며, 이는 GV 단계 정지 난모세포에서 활성 복구 과정의 존재를 의미합니다.
