Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

단핵구로부터 분화된 6번째 인간 단핵구 유래 수지상세포를 약 10배 10회 수집한다. 1.3 곱하기 10을 갖는 24 웰 플레이트의 10 웰에서 웰 당 6 번째 세포로 이동하여 새로운 멸균 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 300G에서 실온에서 5-7분 동안 원심분리한 후 정상적인 브레이크를 사용하여 상층액을 폐기하여 죽은 세포와 파편을 제거합니다.

11.1밀리몰 포도당이 포함된 RPMI 1640 배지 10밀리리터를 튜브에 추가합니다. 300G에서 실온에서 4분 동안 원심분리한 후 노멀 브레이크를 사용하여 상층액을 다시 버립니다. 세포 펠릿에 2mL의 RPMI 1640 배지를 추가하고 1mL의 세포 현탁액을 1번과 2번으로 표시된 두 개의 새로운 멸균 마이크로 튜브로 나눕니다.

마이크로 튜브 1에 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)의 시알리다아제(Sialidase) 500밀리 단위를 추가합니다. 섭씨 37도에서 60분 동안 두 튜브를 배양합니다. 배양 후 두 마이크로 튜브의 세포를 1번과 2번으로 표시된 해당하는 새 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 10%FBS를 함유한 약 4밀리리터의 완전한 RPMI 1640 배지를 각 원뿔형 튜브에 추가합니다. 일반 브레이크를 사용하여 300G에서 4분 동안 실온에서 튜브를 원심분리하고 펠릿에 5ml의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다. 웰당 1밀리리터 세포를 플레이트링합니다.

인간 단핵구 유래 수지상 세포의 표면 아래로 시알산 함량을 감소시키기 위한 Sailidase 처리의 효과는 유세포 분석 및 공초점 현미경으로 평가되었습니다. Sailidase 처리는 Maackia Amurensis lectin과 Sambucus nigra lectin 결합을 유의하게 감소시키는 동시에 Peanut 응집소 렉틴 염색을 증가시켰습니다. Sailidase 처리 후 Sambucus nigra lectin 염색의 감소는 세포 표면에서 Sambucus nigra lectin 염색이 현저히 감소했음을 보여주었습니다.