시작하려면 현미경, 광원, 카메라 및 흡입 시스템을 켜십시오. 관류 시스템을 세척하려면 첫 번째 챔버에서 Ringer의 용액을 사용하고 두 번째 챔버에서 피리티온이 보충된 Ringer의 아연 용액을 사용하십시오. 수도꼭지를 닫은 후 동일한 용액으로 챔버를 채우십시오.
샘플 준비를 시작하려면 홈의 좁은 면이 위를 향하도록 관류 챔버를 놓고 홈 주위에 밀봉 실리콘을 바릅니다. 그런 다음 미세한 핀셋을 사용하여 셀이 아래를 향하도록 홈 위의 세척 용액에서 13mm 커버슬립을 옮깁니다. 22mm 커버슬립 위에 13mm 커버슬립을 놓고 커버슬립이 깨지지 않도록 주의하면서 핀셋을 사용하여 조입니다.
챔버를 뒤집고 눌러 액체를 방출합니다. 그런 다음 홈에 100마이크로리터의 Ringer 세척액을 채우고 다시 눌러 누출이 없도록 합니다. 관류 챔버를 플랫폼에 장착하고 고정합니다.
그런 다음 홈의 세포 위에 관류용 관류 및 흡입 튜브를 부착합니다. 관류 속도를 분당 약 2밀리리터로 변경하고 Ringer의 용액 관류를 켭니다. 측정을 위해 이미징 소프트웨어를 엽니다.
현미경의 왼쪽 버튼을 사용하여 현미경 배율을 10X로 설정합니다. 라이브 뷰를 선택한 후 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 이동하고 홈의 셀에 초점을 맞춥니다. mCherry에 적합한 파장을 선택합니다.
세포에 초점이 맞춰지면 적절한 세포 패치를 선택하기 위해 플랫폼을 이동합니다. ROI 도출 드롭다운 메뉴를 선택합니다. Draw Circular ROIs(원형 ROI 그리기)를 선택하고 mCherry 발현 세포가 있는 셀 클러스터에 ROI를 그립니다.
Shift 버튼을 누른 상태에서 기존 ROI를 누르고 드래그하여 첫 번째 ROI를 넘어 새로운 ROI를 생성합니다. 드롭다운 메뉴에서 Draw Square Background ROI를 선택하고 셀이 없는 배경 ROI의 위치와 크기를 조정합니다. 백그라운드 ROI에 셀이 없는지 확인한 후 ND 획득 탭으로 이동합니다.
Wavelength 하위 탭을 선택하고 확인란을 선택합니다. GFP 파장에 대한 확인란도 선택되어 있는지 확인합니다. 시간 하위 탭을 클릭하고 측정 간격을 5초마다, 지속 시간을 30분으로 정의합니다.
현미경 패널에서 On을 눌러 PFS(Perfect Focus System)를 활성화합니다. ND Acquisition(ND 획득)에서 PFS on(PFS 켜기)이 선택되어 있는지 확인합니다. 포커스를 조정하고 지금 실행을 클릭합니다.
Ringer의 용액 관류를 사용하여 90초 동안 기준선 주기 측정을 시작합니다. 90초 후 Ringer의 용액 관류에서 Ringer의 아연 용액 관류로 전환하고 형광 상승이 포화되기 시작하면 기본 인터페이스 패널의 오른쪽 하단에 있는 빨간색 플래그를 클릭합니다. 실험 시간이 만료될 때까지 Ringer의 용액을 사용하여 관류로 다시 변경합니다.
기준선 빼기를 사용하여 데이터를 내보내려면 배경 보정 버튼을 누르고 ND Acquisition 창에서 변경 사항을 확인합니다. 내보내기 버튼을 클릭하여 원하는 위치에 데이터를 저장합니다. 형광의 증가는 세포 내 아연 농도 증가로 인한 반면, 감소는 세포막을 가로질러 아연을 운반하는 ZnT-1의 활성을 나타냅니다.
야생형 ZnT-1은 아연 부하에 대한 세포 반응의 가변성과 관련하여 돌연변이보다 더 부드러운 형광 곡선을 가졌습니다. 야생형과 델타 USCTD의 활성을 비교한 상자 그림은 유사한 평균 수송 속도를 보였으며, 이는 야생형과 돌연변이 사이에 차이가 없음을 나타냅니다. 그러나 스프레드의 차이는 기능적 차이를 나타낼 수 있습니다.
