우선, 희생된 10주 된 C57 검은색 6J 수컷 쥐에 70% 에탄올을 완전히 뿌립니다. 집게를 사용하여 뒷다리의 피부를 제거하고 대퇴골, 경골 및 비골을 둘러싼 모든 사지 근육을 해부합니다. 채취한 사지 근육을 1밀리리터의 근육 격리 완충액이 들어 있는 2밀리리터 튜브에 넣습니다.
그리고 가위를 사용하여 수확한 근육을 다집니다. 다진 근육 현탁액을 18ml의 근육 격리 완충액이 들어 있는 50mL 튜브에 옮깁니다. 튜브를 단단히 닫고 실험실 필름으로 밀봉한 다음 흔들리는 수조에 수평으로 놓습니다.
30분 후 I형 콜라겐분해효소 5mg을 추가하고 튜브를 30분 더 유지합니다. 근육 현탁액을 위아래로 10회 피펫팅한 후 상층액을 원심분리하고 버리고 튜브에 5밀리리터의 배지를 남깁니다. 현탁액을 연속적인 셀 스트레이너에 피펫팅하고 플로우 스루를 50밀리리터 튜브로 수집합니다.
현탁액을 원심분리하고 튜브에 100-200 마이크로리터만 남을 때까지 상층액을 버립니다. 펠릿을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시키고 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다. 다시 원심분리하고 20 내지 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 튜브에서 상층액을 제거합니다.
펠릿을 100마이크로리터의 차가운 FACS 버퍼에 다시 현탁시키고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 음성 대조군을 위해 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 제거한 후, 나머지 90 마이크로리터를 원심분리하고 상층액을 폐기한 후 실온에서 15분 동안 무혈청 DMEM에 희석된 400 마이크로리터의 고정 가능한 생존도 염색으로 세포를 배양합니다. 원심분리 후 100마이크로리터의 FACS 버퍼를 추가하고 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다.
다시 원심분리하고 100마이크로리터의 1차 항체 혼합물을 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 30분 동안 배양한 후 상층액을 원심분리하여 버립니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS를 추가하여 세포를 세척합니다.
펠릿을 500마이크로리터의 FACS 완충액에 다시 현탁시키기 전에 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 서스펜션을 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 유세포 분석기에서 처리하기 전에 잠시 와류시킵니다.
FACS 완충액이 들어 있는 5밀리리터 코팅 튜브에서 선택한 세포를 수집합니다. 크기와 입도에 따라 확인된 단핵 세포의 75%는 고정 가능한 생존도 염색 마커에 대해 음성으로 나타났으며, 이는 평균 34.3%의 살아있는 세포로 이어졌습니다. 단일 살아있는 세포의 약 3%는 단핵구, 내피, 백혈구 및 적혈구 특이적 마커에 대해 음성이었습니다.
그런 다음 이러한 음성 세포를 CD34 및 ITGA7 마커의 발현에 따라 선택했습니다. CXCR4에 대한 최종 게이팅을 수행하여 추정 위성 셀을 선택했습니다. 그리고 CD34 양성 ITGA7 양성 세포에서 80%가 CXCR4에 대해 양성인 것으로 밝혀졌습니다.
