FACS로 분리된 위성 셀을 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 1밀리리터의 PBS로 세포를 세척하고 원심분리기를 사용하여 얼음 위에서 1밀리리터의 차가운 핵 추출 완충액에서 20분 동안 배양합니다. 20 마이크로 리터의 Concanavalin A 코팅 된 자성 비드를 850 마이크로 리터의 콜드 바인딩 버퍼가 들어있는 1.5 밀리리터 튜브에 첨가하십시오.
그런 다음 마그네틱 랙을 사용하여 1mL의 콜드 바인딩 버퍼로 비드를 두 번 세척하고 비드가 랙의 튜브 측면에 5분 동안 축적되도록 한 후 300마이크로리터의 콜드 바인딩 버퍼에 부드럽게 다시 부유시킵니다. 다음으로, 핵을 원심분리하고 600 마이크로리터의 핵 추출 완충액에 부드럽게 재현탁시킵니다. 그런 다음 추출된 핵 600마이크로리터를 Concanavalin A 비드 슬러리 300마이크로리터와 혼합하고 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.
마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 제거한 후 1mL의 콜드 블로킹 버퍼로 비드 결합 핵을 재현탁합니다. 다시 상층액을 제거하고 1mL의 냉수 세척 완충액으로 비드 결합 핵을 두 번 세척합니다. 상층액을 분리하고 핵 비드 복합체를 특정 1차 항체로 부드럽게 재현탁시키고 부드러운 교반으로 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
다음날 상층액을 제거하고 비드 결합 핵을 세척한 후 100마이크로리터의 냉수 세척 완충액에 다시 현탁시킵니다. 100 마이크로리터의 비드 결합 핵에 희석된 단백질 A-마이크로코칼 뉴클레아제 100 마이크로리터를 첨가하고 섭씨 4도에서 교반하면서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 상층액을 제거하고 비드 결합 핵을 두 번 세척한 후 150마이크로리터의 냉수 세척 완충액에 다시 부유시킵니다.
다음으로, 100 밀리몰 염화칼슘 3 마이크로 리터를 넣고 튕겨서 빠르게 섞은 다음 얼음 위에서 30 분 동안 배양합니다. 150 마이크로리터의 정지 완충액을 첨가하여 반응을 중지하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 펠릿과 비드를 버립니다.
그런 다음 10 % 나트륨 도데 실 설페이트 3 마이크로 리터와 2.5 마이크로 리터의 20 밀리그램 / 밀리리터 단백질 분해 효소 K.Mix를 반전하여 첨가하고 섭씨 70도에서 10 분 동안 배양합니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올과 와류를 첨가 한 후 2 밀리리터 위상 잠금 튜브로 옮깁니다. 원심분리하고 동일한 튜브에 300마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다.
다시 원심 분리하고 상층액을 1.5 밀리리터 튜브에 수집합니다. 다음으로 글리코겐 1마이크로리터를 넣은 다음 100% 에탄올 750마이크로리터를 넣고 DNA가 섭씨 영하 20도에서 밤새 침전되도록 합니다. 다음날 원심 분리로 DNA를 펠렛 한 다음 100 % 에탄올 1 밀리리터로 펠릿을 세척하고 피펫으로 잔류 에탄올을 제거하기 전에 원심 분리를 두 번 실시합니다.
펠릿을 5분 동안 공기 건조시키고 25마이크로리터의 tris-EDTA 완충액에 재현탁시킵니다. H3KME2 및 H3K27AC는 PAC7, ITGA7, LAM2, CXCR4 및 VCAM1의 TSS를 중심으로 강화되었습니다. 그러나 H3K4ME2와 H3K27AC는 ITGAM, PTPRC, PECAM, CKM 또는 MHY3에서 풍부하지 않았습니다.
IgG 샘플에서는 거의 신호가 얻어지지 않았습니다. HOMER 알려진 모티프 분석, AR 피크 및 위성 셀 및 백분율 표적 영역이 표시됩니다. Seeker 분석은 최고 점수가 50 이상인 거의 500개의 피크를 공개했으며 그 중 200개 이상이 100점 이상이었습니다.
