분젠 버너를 사용하여 3개의 목초지 피펫을 불 연마하여 직경을 줄이는 것으로 시작합니다. 다음으로, 안락사된 임신한 마우스 댐의 복부를 70% 에탄올로 소독합니다. 치골 합성에서 흉곽의 xiphoid 과정까지 복강을 잘라냅니다.
이제 복강에서 자궁 뿔을 추출하여 얼음처럼 차가운 HBSS 용액으로 채워진 100mm 플레이트에 넣습니다. 미세한 집게를 사용하여 세척 된 자궁에서 모든 배아를 추출하고 분리하십시오. 추출된 생쥐 배아를 빠르게 참수하고 HBSS로 채워진 60mm 페트리 접시에 머리를 놓습니다.
뇌를 고정하기 위해 안구에 한 쌍의 미세한 집게를 놓습니다. 다른 쌍으로 뇌가 보일 때까지 피부와 두개골을 껍질을 벗기십시오. 두개골의 후각 구근에서 뇌를 퍼내고 거꾸로 뒤집습니다.
복부 쪽의 피질과 등쪽의 시상 하부를 관찰하십시오. 구부러진 집게를 사용하여 뇌가 하얗고 깨끗해 보일 때까지 수막과 혈관층을 제거하고 시상하부 영역을 뇌의 나머지 부분과 분리합니다. 시상 하부를 3-4 개의 작은 미세 조각으로 자르고 피펫을 사용하여 조각을 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 6 밀리리터의 HBSS로 튜브를 채 웁니다. 그런 다음 조직이 안정되고 상청액이 제거되면 효소 혼합물 1을 추가합니다. 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 튜브를 배양하고 5분마다 저어주어 조직을 다시 현탁시킵니다.
이제 30마이크로리터의 Enzyme Mix 2를 추가하고 직경이 큰 목초지 피펫으로 위아래로 10회 피펫팅하여 조직을 해리합니다. 추가 10분 배양 후 나머지 15마이크로리터의 효소 혼합물 2를 추가합니다. 직경이 감소하는 두 개의 내화 연마 피펫을 사용하여 조직을 10회 피펫팅합니다.
즉시 10% BSA가 함유된 HBSS 0.5밀리리터를 튜브에 추가합니다. 그런 다음 튜브를 300G에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 0.5% BSA가 함유된 HBSS 1밀리리터에 세포 펠릿을 다시 현탁합니다.
