분리된 뇌 세포 현탁액을 300G에서 8분 동안 원심분리하는 것으로 시작합니다. 80% BSA 용액으로 HBSS의 0.5마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다. 20 마이크로리터의 비신경 세포 비오틴 항체 칵테일을 추가하고 배양합니다.
0.5% BSA가 함유된 HBSS 2밀리리터로 세포를 세척합니다. 그런 다음 원심분리기 펠릿을 80%BSA가 있는 HBSS의 0.5마이크로리터에 재현탁합니다. 이제 20 마이크로 리터의 안티 비오틴 마이크로 비드를 추가하고 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다.
저온 배양 후 0.5 밀리리터의 HBSS BSA 용액을 첨가한다. 0.5% BSA가 함유된 0.5밀리리터의 HBSS로 컬럼을 헹구기 전에 스탠드를 설치합니다. 그런 다음 컬럼 아래에 15 밀리리터 튜브를 놓고 0.5 밀리리터의 세포 현탁액을 통과시킵니다.
0.5% BSA 용액으로 0.5밀리리터의 HBSS로 3회 세척하여 잔류 신경 세포를 포획합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 새 15밀리리터 튜브 안에 넣습니다. 0.5% BSA가 포함된 HBSS 1밀리리터를 추가하고 플런저를 사용하여 자기적으로 표지된 비신경 세포를 수집합니다.
세포 원심분리 후, 0.5% BSA 용액으로 HBSS 1밀리리터에 세포를 재현탁합니다. 명시야 현미경으로 neubauer 계수 챔버에서 세포를 계수합니다. LepR 양성 뉴런은 48시간 후에 신경돌기를 형성하기 시작했습니다.
DIV4에서 축삭 확장은 수지상 과정이 나타나기 시작하는 동안 진행을 보였다. DIV6에서 뉴런은 충분히 발달되었습니다. 면역 형광 연구에 따르면 신경교 세포 또는 기타 비 신경 세포는 관찰되지 않았습니다.
세포의 신경 성질은 미세소관 관련 단백질 2 염색에 의해 확인되었다. DIV10에서 LepR 양성 세포의 30%가 POMC를 발현했습니다. 시냅스 연결성 및 기능은 이질적인 시상하부 뉴런 집단을 포함하는 일반 배양에서 관찰되었습니다.
