300G에서 8분 동안 쥐-순수 신경 세포 현탁액을 원심분리하는 것으로 시작합니다. 상층액을 부드럽게 흡인하고 0.5 BSA 용액을 사용하여 80마이크로리터의 HBSS에 펠릿을 재현탁합니다. 특정 항체를 첨가 한 후 튜브를 섭씨 4도에서 10 분 동안 배양합니다.
과잉 항체를 HBSS-BSA 용액과 원심분리기로 세척합니다. 펠릿에 20마이크로리터의 항생제 마이크로비드를 추가하고 HBSS-BSA에 재현탁합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.
그런 다음 7개의 셀에 10개마다 0.5% BSA 용액이 포함된 HBSS 0.5밀리리터를 추가합니다. 0.5% BSA 용액으로 0.5밀리리터의 HBSS로 컬럼을 헹굽니다. 물방울이 멈추면 컬럼 아래에 15밀리리터 튜브를 놓고 0.5밀리리터의 세포 현탁액을 통과시킵니다.
비특이적 신경 세포가 포함된 용리액을 수집한 다음 0.5% BSA로 0.5밀리리터의 HBSS를 세 번 세척하여 컬럼을 세척합니다. 이제 자석에서 기둥을 제거하고 새 15 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 0.5% BSA가 함유된 HBSS 1밀리리터를 추가하고 플런저를 사용하여 표적 세포를 씻어냅니다.
원심분리 및 상등액 흡인 후, 펠릿을 0.5 밀리리터의 도금 매체에 재현탁시킨다. Neubauer 계수 챔버의 세포를 명시야 현미경으로 계수합니다. 표적 세포를 양성 대조군으로, 비특이적 세포를 음성 대조군으로 준비된 24-웰 플레이트에 플레이트한다.
섭씨 37도에서 12 시간 동안 배양합니다. LepR 양성 뉴런은 48시간 후에 신경돌기를 형성하기 시작했습니다. DIV4에서, 축삭 확장은 진전을 보였고, 수지상 과정이 나타나기 시작했다.
DIV6에서 뉴런은 충분히 발달했습니다. 면역 형광 연구에 따르면 신경교 세포 또는 기타 비 신경 세포는 관찰되지 않았습니다. 세포의 신경 성질은 미세소관 관련 단백질 2 염색에 의해 확인되었다.
DIV10에서 LepR 양성 세포의 30%가 POMC를 발현했습니다. 시냅스 연결성 및 기능은 이질적인 시상하부 뉴런 집단을 포함하는 일반 배양에서 관찰되었습니다.
