클래스 2 층류 후드 아래에서 작업하는 동안 마우스에서 채취한 혈관 주위 지방 조직 또는 PVAT를 순차적으로 두 번 세척하는 것으로 시작합니다. 먼저 10% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 PBS를 사용하고 다음으로 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 PBS를 사용합니다. 헹궈낸 조직을 멸균된 60mm 페트리 접시에 옮기고 200마이크로리터의 소화 용액을 추가합니다.
멸균 가위를 사용하여 조직을 1 입방 밀리미터 크기의 조각으로 다집니다. 멸균 가위를 사용하여 플라스틱 피펫 팁을 잘라 끝을 넓힙니다. 그런 다음 끝이 넓은 피펫 팁을 사용하여 다진 조직 혼합물을 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
6 밀리리터의 소화 용액을 조직에 추가하여 소화를 시작합니다. 튜브를 랙에 수평으로 묶은 후 섭씨 37도에서 궤도 셰이커에서 30-45분 동안 배양합니다. 5-10분마다 인큐베이터의 셰이커에서 튜브를 꺼내 수동으로 위아래로 세게 흔듭니다.
분해된 조직 혼합물을 70미크론 세포 스트레이너를 통해 50밀리리터 원심분리 튜브에 통과시킵니다. 동일한 양의 배양 배지로 여과기를 헹구어 세포 수율을 최대화하고 소화를 촉진합니다. 여과액을 새로운 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.
튜브를 원심분리하여 기질 혈관 분획(SVF)을 분리합니다. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 펠릿을 5밀리리터의 PBS에 다시 부유시킵니다. 상층액을 버리기 전에 튜브를 1, 800G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
펠릿을 적절한 양의 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 콜라겐으로 코팅된 12웰 플레이트에 세포를 파종하고 이산화탄소 5%가 있는 습한 환경에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 배양 배지를 흡인하고 섭씨 37도로 예열된 항생제 보충 PBS로 세포를 세척하여 세포 파편과 적혈구를 제거합니다.
마지막으로 각 웰에 1밀리리터의 신선한 배양 배지를 추가하고 원하는 밀도 단계에 도달할 때까지 세포를 계속 배양합니다.
