Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

먼저, 갓 분리한 미토콘드리아의 미토콘드리아를 10mg의 미토콘드리아를 피펫팅하여 섭씨 4도의 SM 완충액 1.6ml에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 미토콘드리아 현탁액을 사전 냉각된 100밀리리터 삼각 플라스크로 옮깁니다. 20밀리리터 유리 피펫을 사용하여 얼음 위에서 지속적으로 약한 저어줌을 가하면서 팽창 완충액 16밀리리터를 천천히 추가합니다.

얼음 위에서 30분 동안 지속적으로 약한 교반으로 샘플을 배양합니다. 그런 다음 5 밀리리터 유리 피펫을 사용하여 5 밀리리터의 2.5 몰 자당 용액을 천천히 첨가하여 내막이 수축되도록 합니다. 얼음 위에서 15분 동안 가볍게 저어주면서 샘플을 배양합니다.

미토콘드리아 이하 막 소포를 생성하려면 미토콘드리아 현탁액을 사전 냉각된 로제트 셀로 옮기고 얼음 수조에서 로제트 셀을 냉각하면서 30초 동안 10% 진폭으로 현탁액을 초음파 처리합니다. 얼음 욕조에서 서스펜션을 30초 동안 휴지시킵니다.