Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens for Expressing Exogenous Proteins

시작하려면 RCAS(A)레트로바이러스 스톡을 얼음 위에서 해동합니다. micropipette를 막는 것을 피하기 위하여는, 10에 해결책, 4 섭씨 온도에 10 초 동안 000 G에 분리하고 얼음에 해결책을 지키고 있는 동안 새로운 관으로 상청액을 옮기십시오. 늘어난 실험실 파라필름을 35 x 10mm 세포 배양 접시에 놓고 파라필름에 1마이크로리터의 멸균 PBS를 추가합니다.

준비된 유리 마이크로피펫을 자동 Pico 인젝터에 연결합니다. 충전 모드를 눌러 PBS를 마이크로피펫에 채운 다음 주입 모드를 눌러 할당된 1마이크로리터의 액체를 테스트합니다. 늘어난 실험실 파라필름의 두 번째 조각을 새 세포 배양 접시에 놓고 1마이크로리터의 빠른 녹색 염색 바이러스 스톡을 필름에 추가합니다.

마이크로피펫의 끝을 바이러스 스톡으로 내리고 충전 모드를 눌러 마이크로피펫에 1마이크로리터의 바이러스 스톡을 채웁니다. 해부 현미경 아래에서 자동 주입기에 연결된 채워진 마이크로피펫을 닭 배아 수정체의 대상 영역으로 내립니다. 그런 다음 광원을 조정하여 렌즈 소포를 선명하게 볼 수 있도록 합니다.

마이크로피펫이 렌즈 루멘 내부의 올바른 위치에 있는지 확인한 후 5-40나노리터의 바이러스 스톡을 주입합니다. 주입 후 45초 동안 기다렸다가 마이크로피펫을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 렌즈의 빈 루멘에서 누출 없이 빠른 녹색 염료를 검사하여 미세 주입이 성공했는지 확인합니다.

검사 후 달걀 껍질 입구를 스카치 테이프로 밀봉하고 달걀을 섭씨 37도의 가습 정적 인큐베이터에 넣습니다. 이 연구는 면역형광을 통한 키메라 커넥손 50 및 43 루프의 조직학적 평가를 보여줍니다. Anti-Flag 라벨링을 사용하여 외인성 커넥슨을 내인성 커넥슨과 구별했습니다.

이 연구는 또한 커넥슨 50의 세포 내 루프 도메인과 아쿠아포린 제로 사이의 상호 작용을 평가합니다.