동결건조된 홀로비온트에서 세포내 대사산물을 추출하려면 동결건조된 홀로비온트에 내부 표준물질이 있는 400마이크로리터의 100% 저온 메탄올을 추가합니다. 그런 다음 산성 세척 유리 구슬 10mg을 넣고 튜브를 미리 식힌 비드 밀에 넣습니다. 50Hz에서 3분간 삽입합니다.
용해 후 600 마이크로 리터의 차가운 메탄올과 와류를 1 분 동안 첨가하십시오. 섭씨 4도의 로티세리 셰이커에 튜브를 올려 30분 동안 놓습니다. 분리된 동결건조된 공생세포에서 대사산물을 추출하려면 내부 표준물질이 있는 200마이크로리터의 차가운 메탄올을 건조된 공생세포에 첨가합니다.
그런 다음 산성 세척 유리 비드를 추가하고 튜브를 50Hz로 미리 냉각된 비드 밀 인서트에 넣습니다. 3분 후 800마이크로리터의 메탄올과 와류를 30초 동안 첨가합니다. 분리된 동결건조된 숙주 조직에서 대사 산물을 추출하기 위해 내부 표준물질이 포함된 차가운 메탄올 1mL를 건조된 숙주 물질과 와류에 20초 동안 첨가합니다.
그런 다음 30 분 동안 섭씨 4도에서 초음파 처리를 위해 튜브를 플로팅 튜브 홀더에 넣으십시오. 다음으로 대사 산물 추출물 정제를 위해 모든 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 3000G에서 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 새 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
펠릿을 1밀리리터의 50% 차가운 메탄올에 다시 현탁시키고 1분 동안 세게 소용돌이칩니다. 다시 원심분리한 다음 극성 추출물 상층액을 동일한 샘플에서 반극성 추출물과 함께 수집하고 합합니다. 풀링된 추출물을 16, 100G에서 15분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다.
분석을 위해 각 추출물 50마이크로리터를 유리 인서트에 분취하고 진공 농축기를 사용하여 섭씨 30도에서 30분 동안 농축합니다. GCMS 분석은 아미노산, 유기산, 탄수화물, 지방산 및 멸균 제품군을 포함하여 모든 처리에서 107개의 주석이 달린 대사 산물을 발견했습니다. K는 클러스터링이 3개의 서로 다른 샘플 클러스터를 식별했음을 의미합니다.
홀로비온트 샘플은 분리된 숙주와 공생체 분획 사이의 중간이었다. K는 군집 분포를 의미하지만, 대사체의 상대적 풍부도는 홀로비온트 프로파일이 숙주 분획 프로파일과 더 밀접하게 일치하고 숙주 및 공생체 프로파일 모두와 유의하게 다르다는 것을 나타냅니다. 숙주와 공생체 프로파일은 100개의 개별 대사산물로 서로 현저하게 구별되었으며, 숙주와 공생체 분획 간에 현저하게 달랐습니다.
