새로운 펌프가 필요 없는 다중 채널 유동 배양 시스템을 설정하려면 배지 저장 모듈 또는 MRM을 조립한 후 튜빙 어셈블리를 삽입하고 MRM을 히터에 넣습니다. 히터를 제자리에 고정한 후 조직 챔버 어셈블리 또는 TCA를 관류 챔버 모듈 또는 PCM에 삽입합니다. TCA 삽입 도구를 사용하여 8개의 TCA를 각각 PCM 구멍에 한 번에 하나씩 삽입합니다.
각 챔버 주위의 튜빙 슬리브 상단이 PCM의 구멍을 둘러싼 표면에 닿을 때까지 도구로 어댑터를 단단히 눌러야 합니다. 부분적으로 조립된 PCM을 PCM 버팀대 및 나사 6개와 함께 따로 보관합니다. 인클로저 조립 후 30분 후 MRM이 원하는 온도에 도달한 후 50밀리리터 피펫을 사용하여 액체를 측면 아래로 부드럽게 분산시켜 사전 평형화된 관류액을 예열된 MRM 인서트로 옮깁니다.
그런 다음 PCM을 MRM에 배치하려면 PCM 하단에서 나오는 TCA 저항 튜브를 MRM 분배기의 양쪽에 4개씩 MRM 인서트에 삽입합니다. 조직 챔버가 산소 감지기에 닿도록 모듈 방향을 지정합니다. 6개의 나사와 전기 드라이버를 사용하여 PCM을 지지 버팀대에 고정합니다.
그런 다음 제공된 탄성 밴드를 사용하여 PCM 지지 핀 내의 TCA를 고정하고 고무 개스킷 수준에서 핀 주위를 늘립니다. 산소 감지기를 감지기 스탠드에 놓고 면이 PCM 핀에 닿도록 합니다. 검출기 홀더 측면에 설정된 나사를 풀고 필요한 경우 검출기의 측면 가이드를 조정하여 LED 광검출기 쌍을 조직 챔버의 산소에 민감한 염료와 맞춥니다.
마지막으로 인클로저 위에 뚜껑을 놓습니다. 티슈를 챔버에 로드하려면 미디어 레벨이 상단에서 0.5인치가 될 때까지 기다리십시오. 채취한 망막 또는 RPE 맥락막 공막을 로딩하려면 미세한 점포자를 사용하여 망막을 각 챔버에 접지 않고 부드럽게 놓습니다.
한편, 티슈 챔버 액체가 산소 센서에 떨어지는 것을 방지하기 위해 티슈 물티슈를 사용하십시오. 조직이 FRET쪽으로 가라앉도록 합니다. Transwell 멤브레인에 RPE 셀을 로드하려면 준비된 셀을 0.25% 트립신 EDTA로 통과시킨 후 0.4mm 기공 크기의 폴리에틸렌 테레프탈레이트 트랙 에칭 필터에 시드합니다.
실험 당일, 멤브레인을 3개의 동일한 너비의 스트립으로 자르고 겸자를 사용하여 조직 챔버에 로드합니다. 망막의 산소 소비율(OCR)은 테스트 화합물이 주입되는 동안 일정했으며, 이는 조직의 안정적인 건강과 기능을 나타내며 방법의 타당성을 뒷받침합니다. 망막 및 RPE 맥락막 공막 모두에 대해 기존 관류 방법을 사용하여 얻은 데이터와 일치하게, OCR은 올리고마이신에 대한 반응으로 감소하고 FCCP에 반응하여 증가했습니다.
관찰된 젖산 생산 속도 또는 LPR의 변화는 OCR에서 관찰된 변화와 반대였습니다. 이전에 유동 시스템으로 분석되지 않은 RPE 세포는 이 방법을 사용하여 RPE 맥락막 공막에 유사하게 반응했습니다.
