50 밀리리터 원뿔형 튜브에 60 % 및 70 % 분리 매체의 12 밀리리터 희석액을 준비합니다. 다음으로, 5밀리리터 피펫을 사용하여 70% 희석액에 대해 60% 희석액을 한 번에 4밀리리터씩 추가하여 아래에서 위로 그래디언트를 준비합니다. 그런 다음 밀도 구배 위에 헤파린화된 혈액 12mL를 조심스럽게 겹쳐 놓고 실온에서 200G에서 15분 동안 원심분리합니다.
플라즈마 및 단핵 세포층을 버립니다. 그런 다음 적혈구 펠릿 위의 약 7.5 밀리리터 층을 두 개의 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 섭씨 19도에서 5분 동안 300G에서 튜브를 원심분리합니다.
Hanks'Balanced Salt Solution 또는 HBSS로 세포 펠릿을 세척하십시오. 그런 다음 저긴장성 용해를 수행하고 남아 있는 적혈구를 제거합니다. 상층액을 버린 후 다형핵 호중구를 나머지 완충액에 부드럽게 재현탁시키고 얼음처럼 차가운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 세포 현탁액의 1 마이크로리터 부분 표본 3개를 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 세포 형태와 순도를 평가하기 위해 빠른 panoptic으로 염색합니다. 현미경으로 세포를 관찰하고 각 웰에서 300개의 무작위 세포를 세십시오.
호중구 및 기타 세포 유형을 표시하여 분리의 순도를 평가합니다. 다음으로, 세포 현탁액 1마이크로리터를 0.2% 트리판 블루 염료 49마이크로리터로 옮기고 Neubauer 챔버를 사용하여 죽은 세포와 생존 가능한 세포를 계산합니다. 세포 농도를 6, 칼슘과 마그네슘으로 보충된 50%autologous 플라스마 및 50%HBSS를 가진 마이크로리터 당 667의 세포에 조정하십시오.
그런 다음 셀 현탁액을 음성 대조군을 포함한 테스트 조건에 해당하는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 균등하게 나눕니다. 최종 세포 농도가 마이크로리터 당 6, 600개의 다형핵 호중구에 남아 있다는 것을 보증하는 각 조건을 위한 활성화 체계를 준비하십시오. 회전하지 않고 섭씨 37도에서 배양합니다.
