IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

먼저 2mL DPBS로 멤브레인 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트에서 유도만능줄기세포(iPSC)를 세척합니다. 피펫을 사용하여 DPBS를 흡인합니다. 다음으로, 시판되는 세포 분리 용액 1mL를 추가하여 iPSC를 분리합니다.

그런 다음 세포를 37도의 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다. 이제 mTeSR 1mL를 iPSC에 피펫팅하여 세포가 플라스틱 표면에서 분리되었는지 확인합니다. 이 세포를 400g에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.

세포 펠릿을 재현탁한 다음 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 다음으로, 멤브레인 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트에 다양한 세포 밀도를 파종합니다. 10 마이크로몰 Rho-kinase 억제제가 보충된 mTeSR로 이들을 배양합니다.

섭씨 37도로 설정된 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 mTeSR을 흡인하고 2mL의 DPBS로 세포를 세척합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 1 단계 배지를 세포에 첨가합니다.

그런 다음 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 4일 동안 넣습니다. 4일째 되는 날, 1단계 배지를 제거하고 2mL의 DPBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 이전과 같이 세포를 배양하기 전에 2단계 배지 2mL를 세포에 추가합니다.

0일차부터 4일차까지 iPSC는 빠르게 팽창하여 마름모꼴 또는 삼각형 모양을 취했습니다. 합류도는 90-100%에 도달했으며 7일째까지 고르게 축적되었습니다. 현탁 배양 시 응집체는 7일째에 해리된 후 자발적으로 네프론 구조를 형성합니다.