Ex Vivo Calcium Imaging of Flat-Mounted Rat Retina upon Electrical Stimulation

GCL이 현미경 스테이지의 전극을 향하도록 하여 MEA에 장착된 GCaMP 5G 발현 쥐 망막을 놓습니다. 관류 시스템을 연결하고 산소가 공급된 AMS 배지로 시료 수조를 지속적으로 관류하도록 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 형광 램프, FITC 필터 및 CMOS 카메라가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 망막을 검사합니다.

자극 전극과 GCaMP 발현 세포의 형광을 볼 수 있는 영역을 찾으십시오. 펄스 발생기 장치 소프트웨어에서 적용을 위한 펄스의 모양, 진폭, 지속 시간, 위상 지연 및 주파수와 같은 전기 자극 매개변수를 구성합니다. 출력 트리거 신호를 사용하여 카메라를 펄스 발생기에 연결하고 카메라 소프트웨어의 캡처 모드를 외부 시작 트리거로 설정합니다.

카메라 소프트웨어의 시작 버튼을 눌러 외부 트리거가 시작될 때까지 기다립니다. 펄스 발생기 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득 프로세스를 시작하고 캡처된 이미지를 저장하여 파일 이름에 적용된 모든 전기 자극 파라미터가 포함되도록 합니다. 이제 영상 J를 열고 영역 선택 툴을 사용하여 관심 영역을 분할하고, 이를 ROI 매니저에 추가하고, ROI 매니저 메뉴를 사용하여 zip 폴더로 저장합니다.

더 보기로 이동하고 다중 측정을 클릭하여 세포 somas에서 평균 회색 값을 추출합니다. 600개 슬라이스 모두 측정 및 슬라이스당 한 행 옵션을 활성화하여 열이 ROI에 해당하고 행이 기간에 해당하는 단일 테이블을 얻습니다. 그런 다음 measure 명령을 사용하여 ROI에서 중심을 추출합니다.

사진 표백 효과를 보정하고 배경을 최소화하려면 각 버스트 전에 자극적이지 않은 간격에서 약 15-20프레임을 선택하고 이러한 프레임을 선형 곡선에 맞추어 최적의 데이터 분석을 보장합니다. 60초의 이미지 획득 동안 10초마다 5번의 펄스 트레인 버스트에 대한 세포 소마의 칼슘 흔적이 표시됩니다. 자극적이지 않은 기간의 프레임은 사진 표백 효과를 보정하는 데 사용됩니다.

세포를 활성화하는 데 필요한 전류와 자극 전극으로부터의 거리 사이의 관계는 자극 전극에 더 가까운 세포가 반응을 불러일으키기 위해 더 낮은 전류 값을 필요로 한다는 것을 보여주었습니다.