시작하려면 각각 12.5 x 7.5cm 크기의 여과지 4장을 준비합니다. 두 장의 시트를 함께 쌓고 스택을 전송 버퍼에 넣어 스며들게 합니다. PVDF 멤브레인을 95% 에탄올에 넣고 로커에서 멤브레인을 1분 동안 교반합니다.
에탄올을 회수하십시오. 멤브레인을 이송 버퍼에 담그십시오. 그리고 2분 동안 저어줍니다.
그런 다음 담근 여과지 더미를 큰 뚜껑과 같이 평평하고 움직일 수 있는 표면에 놓고 롤러를 사용하여 평평하게 펴십시오. 젤 이형제 또는 핀셋을 사용하여 PVDF 멤브레인을 스택에 조심스럽게 배치합니다. 그런 다음 이 멤브레인에 마른 여과지 한 장을 놓고 롤러를 용지 위로 미끄러지듯 움직여 멤브레인 표면에 있는 과도한 완충액을 흡수합니다.
멤브레인을 문지르지 않고 상단 여과지를 들어 올립니다. 냉동실에서 분리된 섬유 샘플을 가져와 실온에서 해동한 후 원심분리하고 샘플을 완전히 다시 부유시킵니다. 각 샘플의 1마이크로리터 방울을 지정된 멤브레인 영역의 중앙에 놓습니다.
피펫 팁으로 멤브레인을 만지지 마십시오. 샘플 방울이 15분 동안 멤브레인에 완전히 흡수되도록 합니다. 그런 다음 젤 이형제나 핀셋을 사용하여 젖은 여과지 더미에서 멤브레인을 조심스럽게 들어 올립니다.
마른 여과지 위에 놓고 탈수를 위해 최소 5분 동안 그대로 두십시오. 샘플 반점이 완전히 흰색으로 변한 후 멤브레인을 다시 활성화합니다. 그런 다음 표적 단백질에 대한 면역 표지를 진행합니다.
신호 패널 명암을 사용하여 도트 블롯 영상에서 MHC 동형과 Actin 신호의 명암을 분류하는 방법을 알아봅니다. 강, 중간 및 작은 표적 단백질 검출은 각각 포화, 중간 및 희미한 신호로 표시됩니다. 섬유 유형 식별을 위해 먼저 미오신 중쇄 IIA와 미오신 중쇄 1 결과를 비교합니다.
포화 또는 중간 정도의 신호 강도를 가진 단일 myosin 중쇄 동형만 표시하는 섬유를 문서화합니다. Actin으로 검출된 섬유를 기록하고 잠재적인 유형 2X로 myosin 중쇄 1 또는 IIA가 검출되지 않은 것을 기록합니다. 희미한 미오신 중쇄 동형 신호가 중간 정도의 불포화 액틴 신호와 함께 존재하는 경우 미확인으로 기록하십시오.
희미하거나 검출되지 않은 표적 단백질이 있는 샘플은 폐기하십시오. MHCIIA 및 MHC1의 포화 또는 중간 신호를 나타내는 섬유는 섬유 유형별 준비에 사용해서는 안 됩니다. MYO1D ID 후 각 MHC 동형에 대해 포화 또는 중간 정도의 신호를 가진 섬유를 결합하여 유형 1 및 2 샘플을 준비합니다.
각 섬유 유형별 샘플 10마이크로리터를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 SDS 페이지로 프리캐스트 겔에서 분리합니다. 겔 이미저를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 표적 MHC 동형을 검출합니다. 모든 섬유 유형별 샘플에서 각 MHC 동형의 신호 강도를 비교합니다.
광섬유 유형 ID는 중간 또는 포화 신호 강도에서 올바른 MHC 동형에 의해 확인됩니다. 도트 블롯의 면역 표지를 통해 유형 2 섬유, 유형 1 섬유 및 잠재적 유형 2X 섬유를 식별할 수 있었습니다. 섬유 유형 특이적 샘플은 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 미오신 중쇄 특이적 항체를 사용하여 검증되었습니다.
