In Vivo Matrix Gel Plug Assay를 위한 혈관 세포 준비

먼저 460ml의 내피 세포 배지를 사용하여 완전한 내피 배양 배지를 준비하고 FBS 50ml, 페니실린 스트렙토마이신 5ml, 내피 세포 성장 보충제 5ml를 첨가합니다. 준비된 미디어는 섭씨 4도에서 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 다음으로, 제조된 완전한 내피 배양 배지 8ml에서 0.1백만 개의 혈관 세포를 포함하는 100mm 조직 배양 접시에서 세포를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 70%의 공동 유창성이 달성될 때까지 배양합니다.

그런 다음 접시에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 헹구어 부착되지 않은 세포와 파편을 제거합니다. PBS를 제거한 후 2.21 밀리몰 EDTA를 함유 한 0.25 % 트립신 3 밀리리터를 세포에 넣고 섭씨 37도에서 1 분 동안 접시를 배양합니다. 광학 현미경으로 40배 배율로 세포 분리를 확인합니다.

7mL의 완전한 내피 배양 배지로 트립신을 중화하고 배양 접시에서 세포를 부드럽게 헹굽니다. 셀 현탁액을 15G에서 400밀리리터 튜브에 수집한 후 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 5mL의 완전한 내피 배양 배지에 세포를 다시 현탁시킨 다음 혈구측정기를 사용하여 세포를 계수하고 200만 개의 세포를 포함하는 계산된 현탁액 부피를 멸균된 1.5mL 튜브로 옮깁니다.

상층액을 제거하기 전에 400G에서 5분 동안 현탁액을 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 혈관 세포는 이제 매트릭스 겔 플러그 분석을 위해 매트릭스 겔과 혼합할 준비가 되었습니다.