시작하려면 안락사 된 쥐에게 75 % 알코올을 뿌립니다. 그런 다음 해부 가위를 소독하여 피부를 열고 흉강을 노출시킵니다. 횡격막을 자른 다음 아래턱을 향해 위쪽으로 계속 자르고 경동맥을 노출시키는 과도한 결합 조직과 지방을 조심스럽게 제거합니다.
다음으로, 하대정맥을 잘라 닫힌 순환계에서 혈류가 나오도록 합니다. 주사기를 사용하여 미리 냉각된 관류 용액 20ml를 좌심실에 천천히 주입합니다. 마우스를 입체 현미경 아래에 놓습니다.
그런 다음 미세 해부 가위를 사용하여 경동맥 주변의 지방과 결합 조직을 벗겨냅니다. 경동맥을 분리하고 PBS로 세척하여 잔류 혈액을 씻어냅니다. 동맥을 얼음 위에 1.5%FBS가 들어 있는 6웰 플레이트로 옮깁니다.
마이크로 해부 가위를 사용하여 경동맥을 세로로 절개하고 얼음 위에 1밀리리터의 FBS가 들어 있는 새로운 6웰 플레이트에 평평하게 놓습니다. FBS로 동맥 내막을 조심스럽게 씻어내어 잔류 혈액을 제거합니다. 동맥을 2mm 정사각형 조직 조각으로 자르고 1.5mm 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
섭씨 4도에서 400G에서 5분 동안 원심분리하여 조직을 바닥으로 가라앉힙니다. 상층액을 버리고 500 마이크로리터의 해리 시약에 조직을 다시 부유시킵니다 A.튜브를 섭씨 37도의 수조에 1시간 동안 놓고 10분마다 1밀리리터 피펫으로 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 5 % FBS를 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
멸균 40미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 1.5밀리리터 튜브로 여과합니다. 그런 다음 여과액을 원심 분리하고 상층액을 제거한 후 펠릿을 200 마이크로 리터의 해리 시약 B에 다시 현탁시킵니다. 5분 후, 200마이크로리터의 5%FBS를 첨가하여 분해 반응을 종료하고, 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 폐기한 후 펠릿을 얼음 위의 100마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다.
현미경 관찰 결과, 해리 시약 B와 시약 A를 병용하면 해리 시약 A를 단독으로 사용하는 것에 비해 경동맥 조직이 더 철저하게 해리되는 것으로 나타났습니다. 총 176, 000개의 단일 세포가 9개의 좌경동맥에서 수집되었으며 대부분의 혈관은 생존력이 높은 단일 세포로 성공적으로 해리되었습니다. 소화 후 감독되지 않은 SIRAH 기반 클러스터링은 정상 마우스 경동맥에서 4가지 주요 세포 유형을 밝혀냈습니다.
