시작하려면 장갑, 카트리지 및 배양 플레이트를 70% 에탄올로 세척하여 멸균 상태를 유지하십시오. 그런 다음 바이오프린터용 압축기를 켜고 초기화된 버튼을 선택하여 프린터를 초기화합니다. 70% 에탄올로 프린터 내부 표면을 닦습니다.
인쇄 실행 버튼을 사용하여 인쇄 파일을 로드하고 인쇄 프로토콜 PDF를 엽니다. 바이오잉크, 활성제 유체 및 50mL의 전체 배지를 실온에서 해동합니다. 인쇄 프로토콜 PDF의 지침에 따라 인쇄 카트리지를 준비하여 지정된 구획에 올바른 양의 시약을 보관합니다.
다음으로, C1에 1.2밀리리터의 F3, C2에 1.2밀리리터의 F32, C4에 200마이크로리터의 F261을 추가합니다. 인큐베이터에서 폴리에틸렌이민 및 라미닌 코팅판을 제거합니다. 플레이트 홀더 구획을 로우 프로로 설정file 플레이트. 프린터의 오른쪽 플레이트 홀더 칸에 플레이트를 삽입합니다.
접시에서 뚜껑을 제거하고 뚜껑 홀더에 넣습니다. 잉크 카트리지를 바이오프린터에 넣고 Print Inert Base 버튼을 선택하여 인쇄 실행을 시작합니다. 해동 후, 글루타민성 뉴런과 성상교세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 두 세포 유형을 1밀리리터의 완전한 배지에 개별적으로 재현탁시킵니다.
20 마이크로리터의 세포 현탁액을 동일한 부피의 트리판 블루와 혼합하고 세포를 계수하여 각 세포 유형에 대한 생존 가능한 세포 농도를 결정합니다. 다음으로, 15밀리리터 튜브에 300만 개의 글루타민성 뉴런과 100만 개의 성상교세포를 결합하고 완전한 배지를 추가하여 최종 부피 8밀리리터를 만듭니다. 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다.
펠릿을 200마이크로리터의 활성제 유체 F299에 피펫팅하여 위아래로 현탁합니다. 카트리지와 배양 플레이트에 뚜껑을 놓고 바이오프린터에서 꺼냅니다. 생물 안전 캐비닛에서 200마이크로리터의 셀 현탁액을 잉크 카트리지의 웰 C3에 추가합니다.
카트리지를 바이오프린터에 다시 삽입하고 앞에서 설명한 대로 뚜껑을 제거합니다. 인쇄 실행의 인쇄 모델 단계를 시작합니다. 동시에 2D 컨트롤 플레이트의 라미네이트 미디어를 완전한 미디어로 교체합니다.
바이오프린팅 타겟팅 플레이트를 바이오프린터에 삽입하고 뚜껑을 제거합니다. 바이오프린트 타겟팅 프로세스를 시작합니다. 메시지가 표시되면 바이오프린터에서 표적 플레이트를 제거합니다.
가이드를 사용하여 플레이트에서 물방울을 관찰할 수 있는 위치를 식별하십시오. 표적 플레이트를 바이오프린터에 다시 삽입하여 액적 인쇄 및 선택 과정을 반복합니다. 메시지가 표시되면 표적 플레이트를 세포 배양 플레이트로 교체합니다.
인쇄 후 모든 3D 공동 배양 웰에 완전한 배지를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 마지막으로 카트리지와 남은 액체를 폐기하십시오. 실험실 프로토콜에 따라.
인쇄한 지 7일 후, 단일 세포는 거의 남지 않았고 신경돌기와 성상세포의 상호 연결된 다발이 강화된 것으로 나타났습니다. 신경돌기 성장은 12시간에서 156시간 사이에 선형적으로 증가했다. 신경돌기가 자라는 동안, 세포체 클러스터의 크기도 증가했다.
세포 생존율 분석 결과, 전체 세포의 약 72%가 4일째에 살아 있었고 29%는 죽은 것으로 나타났습니다. 면역염색을 통해 바이오프린팅된 뉴런과 성상세포의 건강한 세포 형태를 확인했으며, 두 세포 유형 모두 세포 돌출부의 성장을 나타냈습니다. 뉴런의 글루타민성 표현형은 글루타메이트 수용체 2에 대한 면역염색을 통해 확인하였다.
