저자는 프로토콜 개발과 원고에 대한 피드백에 도움을 준 Alex Volkerling, Martin Engel 및 Rachel Bleach에게 감사의 뜻을 전합니다.

iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양

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CW, NC 및 JB는 영국 런던에 소재한 Merck Sharp & Dohme (UK) Limited의 직원입니다. YH는 Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA의 자회사 인 Merck Sharp & Dohme LLC의 직원입니다.
그림 1은 Biorender.com 를 사용하여 만든 것입니다.

CNS의 정확한 모델에 대한 필요성이 그 어느 때보다 높아졌으며, 2차원(2D) 기존 세포 배양 모델의 한계로 인해 최근 몇 년 동안 복잡한 CNS 모델이 생성되었습니다19. 그러나 신경 세포 유형과 ECM 간의 상호 작용을 나타내는 많은 복잡한 3D 모델은 산업 공정에서 이러한 모델의 적용을 방해하는 한계가 있습니다 6,20,21. 이 프로토콜에서는 인간 iPSC 유래 뉴런 및 성상교세포의 3D 공동 배양 모델을 개발하며, 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 96웰 및 384웰 형식의 생체 활성 하이드로겔 스캐폴드를 만드는 것을 목표로 이러한 한계 중 일부를 해결하는 것을 목표로 합니다.
이러한 모델을 개발하기 위한 방법론은 플레이트 맵 설계 소프트웨어, 자동 생성된 인쇄 프로토콜 및 바이오프린터의 안내된 인쇄 프로세스를 통해 단순화되었습니다. 그러나 이 프로토콜에 사용된 민감한 iPSC 유래 세포 유형의 민감한 특성으로 인해 해동 및 배양에서 다음과 같은 중요한 단계를 거쳐야 합니다. 첫째, ROCK 억제제(ROCKi)의 포함은 바이오프린팅 과정과 초기 배양 전반에 걸쳐 여러 가지 이점이 있습니다. 세포 해동은 뉴런이 스트레스 반응을 경험할 수 있는 임계점이며, 부적절한 해동 프로토콜은 생존 가능성을 낮출 수 있다22. 일반적으로 세포를 해동하고, 배지를 추가하고, 세포를 가능한 한 효율적으로 인큐베이터 온도로 올리는 것이 좋습니다23. 그러나, 본 프로토콜에 기술된 바이오프린팅 공정 동안, 뉴런 및 성상교세포는 배지가 아닌 활성제 용액에 재현탁될 필요가 있으며, 세포는 프린트 실행이 끝날 때까지(해동 후 최대 30분까지) 실온 이상으로 상승되지 않을 것이다. 따라서, 해동 직후 배지에 ROCKi를 첨가하고 두 개의 원심분리 단계(단계 2.1--2.7 및 1.3.15-1.3.20 단계) 동안 이를 포함하는 것은 세포 스트레스 경로를 억제하는 데 필수적이며, 이는 생존도 수준을 낮추는 결과를 초래할 것이다24. 또한, ROCKi는 신경돌기 성장을 촉진하고 신경 세포 성숙을 개선하는 것으로 나타났습니다25. 따라서 ROCKi 보충은 바이오프린팅 후 48시간 동안 계속됩니다. 그러나 세포를 분석에 사용하기 전에 후속 배지 교체 중에 완전히 씻어낼 수 있도록 48시간 후에 ROCKi 보충제를 제거하는 것이 필수적입니다.
중요한 주의가 필요한 추가 단계는 인쇄 후 미디어 추가 및 미디어 변경 중입니다(2.8-2.13단계). 바이오프린팅된 하이드로겔 스캐폴드는 회백질에 해당하는 1.1kPa에 불과한 생체역학적 강성을 가지고 있습니다. 2.10단계에서 설명한 바와 같이, 교란을 방지하기 위해 배지 추가 및 흡인 중에 웰 측면에 피펫팅을 부드럽게 하는 것이 중요합니다. 이는 겔 레벨이 전체 웰 부피에서 더 높은 비율을 차지하는 384웰 플레이트와 특히 관련이 있습니다. 이 방법은 세포의 가장자리 리프팅 및 신경돌기 돌출물의 전단을 방지하기 위해 2D 제어 웰에서도 사용해야 합니다. 저자는 또한 iPSC 유래 세포 배양에 사용되는 생물 안전 캐비닛과 동등한 주의를 기울여 취급해야 하는 바이오프린터 내 멸균 기술의 중요성을 강조하고자 합니다. 여기에는 그린라이팅 및 인쇄 절차에 사용되는 70% EtOH 및 dH2O의 멸균 필터링, 바이오프린터 안팎으로 손을 움직이는 동안 카트리지 및 플레이트의 뚜껑 유지, 인쇄 전후에 70% 에탄올 와이프로 바이오프린터 내부 표면의 오염 제거가 포함됩니다.
이 모델을 개발하기 위해 선택된 바이오잉크 및 활성제 용액으로 형성된 바이오프린팅 하이드로겔 스캐폴드는 RASTRUM 바이오프린터 내에서 사용하기 위해 Inventia Life Science에서 개발한 다양한 바이오잉크 및 활성제 솔루션 중에서 선택됩니다. 라미닌과 히알루론산은 축삭 유도, 시냅스 형성 및 신경 주위 그물 형성에 대한 역할로 인해 iPSC 유래 신경 세포 성숙과 관련된 분자로 확인되었습니다26,27. 또한, 1.1kPa의 생체역학적 강성이 선택되었는데, 이는 저밀도 하이드로겔이 뉴런12로부터 더 나은 신경돌기 성장을 가능하게 하는 것으로 나타났기 때문이다. 사내에서 또는 다른 상업적 공급자로부터 분화된 뉴런 및 성상교세포를 사용하여 프로토콜을 수정하는 경우, 가장 지지력이 높은 하이드로겔 스캐폴드(15)를 결정하기 위해 매트릭스 선택 테스트를 수행하는 것이 권장될 것이다. 또한, 최적의 생존력을 보장하고 하이드로겔 과밀화를 방지하기 위해 세포 공급원을 변경하는 경우 세포 밀도를 최적화해야 할 수도 있습니다. 바이오프린터 기능과 관련된 모든 수정 및 문제 해결에 대해 저자는 제조업체에 문의하고 제조업체 프로토콜을 참조할 것을 권장합니다.
중추신경계(CNS)는 광범위한 신경 아형(neuronal subtype)과 신경교세포(glial cell)를 포함하고 있으며, 이들 모두는 서로 다른 뇌 틈새에 존재하며 신경 기능에 기여하는 특정한 역할을 한다28. 이 광범위한 범위의 맥락에서 이 모델은 가장 풍부한 두 가지 세포 유형(성상교세포와 흥분성 글루타민성 뉴런)만을 나타냅니다. 미세아교세포(microglia), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 혈액뇌장벽(blood-brain barrier-form) 내피세포와 같은 중요한 세포 유형은 이 시스템에서 생략됩니다. 미세아교세포의 포함은 신경면역 상호작용에 초점을 맞추는 것과 관련이 있을 수 있으며, 희소돌기아교세포는 중추 수초화에 영향을 미치는 질병에 관심이 있을 수 있습니다. 병리학에서의 역할 외에도 혈액-뇌 장벽 형성 내피 세포와 같은 세포는 약물 대사 효소를 분비하며, 이는 약동학 분석을 위한 이 모델의 사용에 영향을 미칠 수 있습니다29. 모델의 또 다른 한계는 성상교세포(astrocyte)와 뉴런(neuron)의 비율일 수 있다. 성상교세포(astrocyte)와 뉴런(neuron)의 비율은 뇌 부위에 따라 크게 다르며, 1:1에서 1:3 사이의 값이 제안된다30,31. 이 모델은 대략 1:1.5 성상교세포와 뉴런의 비율을 가지고 있습니다. 따라서, 이 모델은 성상교세포(astrocyte)가 더 풍부한 뇌 영역(예: 백질 영역(30))을 모델링하는 것과는 관련이 없을 수 있다.
최근 몇 년 동안 3D 바이오프린팅 공동 배양 모델을 개발하기 위한 다른 프로토콜이 발표되었습니다. Sullivan et al., 2021의 간행물에서는 iPSC 유래 신경 전구 세포를 사용하여 3D 바이오프린팅 신경 모델을 제시했으며, 이는 2D 배양에 비해 높은 인쇄 후 생존력과 신경 기능 향상을 보여줍니다32. 그러나, 이 프로토콜에서는 신경 전구 세포를 세포 공급원으로 사용하였고 4주 동안 배양하였다. 이 프로토콜에서는 상업적으로 이용 가능한 iPSC 유래 글루타민성 뉴런 및 성상세포를 사용했습니다. 이를 통해 공동 배양 세포의 3D 네트워크를 7일 이내에 구축할 수 있습니다. 신경돌기 성장 분석에서 입증된 바와 같이, 신경돌기 성장은 24시간 이내에 시작되어 세포 성장을 모니터링한 156시간 동안 선형 방식으로 계속됩니다. 이러한 네트워크의 빠른 구축은 부분적으로 NGN2의 최적화된 독시사이클린 유도 유전자 발현을 사용하는 글루타민성 뉴런의 사용에 기인할 수 있으며, 이는 2D 배양에서도 7일 이내에 성숙한 뉴런 아형 마커의 발현을 보여줍니다33. 이 기술을 사용하여 이러한 성장 기간을 단축하는 것은 분석 개발이 세포 모델15의 신속한 턴어라운드와 개발을 필요로 하기 때문에 바이오 제약 산업 내에서 모델을 구현하는 데 중요합니다.
결론적으로, 이 모델은 스크리닝 목적으로 빠르고 편리하게 확립된 뉴런 및 성상교세포의 3D 모델에 대한 가능성을 보여줍니다. 이 모델 유형의 향후 응용 분야는 환자 또는 유전자 편집 질환 iPSC 라인을 사용하여 다양한 질병으로 확장할 수 있는 기회와 함께 다양한 CNS 질환에 대한 약물 발견 노력에 사용될 수 있습니다. 또한, 독시사이클린 유도 NGN2 발현 iPSC 유래 글루타마테르성 뉴런을 사용하면 세포가 더 짧은 시간에 성숙할 수 있으며, 이는 신경 퇴행 연구를 위한 노화 뇌 모델 개발에 활용될 수 있습니다. 이 시스템은 또한 미세아교세포(microglia)와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 포함한 공동 배양에서 추가 세포 유형을 사용하여 확장될 수 있습니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated from:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD R&#38;D Innovation Centre Ltd 
2Merck &#38; Co., Inc.
to:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD Research Laboratories, London, UK 
2Merck &#38; Co., Inc., Rahway, NJ, USA

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

신약 개발 산업에서 중추신경계(CNS) 질환에 대한 연구가 확대되고 있습니다1. 그러나 간질, 정신분열증, 알츠하이머병과 같은 많은 중추신경계 질환은 여전히 완치법이 없다 2,3,4. 중추신경계 질환 전반에 걸쳐 효과적인 치료법이 부족한 것은 적어도 부분적으로는 정확한 뇌 체외 모델이 부족하기 때문이라고 할 수 있다5. 이로 인해 현재 in vitro 모델과 in vivo 데이터 간의 중개 격차가 발생하고 연구 노력에 병목 현상이 발생했습니다.
이러한 중개 격차로 인해 최근 몇 년 동안 신경 오가노이드, 신경 스페로이드 및 스캐폴드 기반 모델을 포함한 새로운 3D 세포 모델의 개발이 크게 증가했습니다6. 이러한 모델의 3D 구조는 생체역학적 스트레스, 세포 간 접촉 및 뇌 세포외 기질(ECM)을 포함한 신경 미세환경을 재현하는 데 도움이 됩니다7. 뇌 ECM은 신경 세포, 성상 교세포, 희소돌기아교세포 및 신경 혈관 단위7을 포함한 신경 세포 유형 사이의 공간을 차지하는 신경 생리학의 동적 요소입니다. 뇌 ECM의 재현은 신경 형태 및 신경 세포 발화에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 뇌의 많은 복잡한 3D 모델은 신경 세포 유형 8,9,10,11에 의한 ECM 단백질의 침착을 입증했습니다. 스캐폴드 기반 모델은 뇌 ECM(12)을 나타내는 다공성 합성 또는 생물학적 하이드로겔 매트릭스에 현탁된 성숙한 신경 공배양으로 구성됩니다. 오가노이드 및 스페로이드 시스템과 달리 스캐폴드 기반 3D 모델을 사용하면 존재하는 ECM 단백질을 맞춤화할 수 있으며 생체역학적 응력을 모방하기 위해 하이드로겔 강성을 조정할 수 있는 추가 이점이 있습니다13,14.
압도적 다수의 3D 신경 모델이 뇌 미세환경의 재현이 증가했음을 보여주지만, 모든 모델이 신약 개발 애플리케이션을 구현하는 데 적합한 것은 아니다15. 3D 모델이 산업 공정에 구현되려면 시스템이 스크리닝 응용 분야에 대한 처리량 요구 사항을 충족하고 개발 시간이 비교적 짧아야 합니다16. 3D 바이오프린팅은 인적 오류로 인한 변동성 제거와 함께 빠른 개발 시간, 처리량 증가, 더 높은 수준의 정밀 제어를 통해 3D 스캐폴드 기반 신경 모델을 생성할 수 있는 잠재력을 제공하는 새로운 기술입니다17. 이 프로토콜은 하이드로겔 스캐폴드에서 인간 iPSC 유래 글루타민성 뉴런 및 성상세포의 3D 공동 배양 모델을 제시합니다. 이 하이드로겔 스캐폴드는 생리학적으로 대표적인 생체 활성 펩타이드(RGD, IKVAV, YIGSR)와 ECM 단백질을 모방 생체역학적 강성 내에 함유하고 있습니다. 이러한 전장 ECM 단백질은 전장 라미닌-211과 히알루론산을 포함하며, 이는 인간 피질에 풍부하며, 생체 내 측정치에 따라 1.1kPa의 강성을 갖는다18. 이 모델은 신약 개발을 위해 실용적으로 설계되었으며, 신경돌기 돌출 분석과 함께 세포 염료 및 항체와 함께 이미징 기술을 사용한 스크리닝 분석에 적합한 96웰 또는 384웰 플레이트 형식의 3D 바이오프린터를 사용하여 생성됩니다. 세포는 배양 후 7일 이내에 신경 세포 유형 마커의 발현과 신경돌기 및 성상세포 돌기의 성장을 보여줍니다. 따라서 이 프로토콜은 약물 발견 응용 분야에 사용하기 위한 고처리량 3D 신경 공동 배양 모델을 개발하는 방법론을 제시합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg"> 그림 1: 3D 바이오프린팅 공동 배양에 사용되는 방법론의 예시적 개요. 인간 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포는 생체 활성 펩타이드를 함유한 활성제 및 바이오잉크 용액과 결합되며 드롭온디맨드 바이오프린팅 기술을 사용하여 96웰 또는 384웰 형식으로 하이드로겔 스캐폴드에 바이오프린팅됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activator fluid F299</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activator fluid F3</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50x) minus Vit A</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink fluid F261</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink fluid F32</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG H&#38;L Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG H&#38;L Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NT3 Recombinant Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHC7036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Astrocytes</td>
			<td>Fujifilm CDI</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCell Analyser 6500HS</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>high content imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3</td>
			<td>Sartorius&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ioGlutamatergic Neurons (Large vial)</td>
			<td>Bit.bio</td>
			<td>e001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>SC024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live (Hoechst 33342)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI 50% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>181978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Borate Buffer 20x</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab206293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RASTRUM(TM) Bioprinter</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioprinter Cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RASTRUM(TM) Targeting plate</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Targeting plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase (ROCK) inhibitor</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-GFAP NL493 conjugated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>SC024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signals Image Artist&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted microscope platform&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional bioprinting of human ipsc-derived neuron-astrocyte cocultures for screening applications

세포 모델이 약물 스크리닝에 적합하려면 시스템이 효율적인 개발 시간과 함께 처리량 및 균질성 요구 사항을 충족해야 합니다. 그러나 게시된 많은 3D 모델은 이러한 기준을 충족하지 않습니다. 따라서 이는 초기 약물 발견 응용 분야에서 유용성을 제한합니다. 3차원(3D) 바이오프린팅은 3D 모델 개발에 적용하여 개발 시간을 단축하고 표준화를 높이며 처리량을 늘릴 수 있는 새로운 기술입니다. 여기에서는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 글루타마테르성 뉴런 및 성상교세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 공동 배양은 생체 활성 펩타이드, 전장 세포외 기질(ECM) 단백질의 하이드로겔 매트릭스 내에 내장되어 있으며 생리학적 강성은 1.1kPa입니다. 이 모델은 96웰 및 384웰 형식으로 신속하게 확립할 수 있으며 평균 72%의 인쇄 후 생존율을 생성합니다. 이 모델에서 성상세포(astrocyte) 대 뉴런(neuron)의 비율은 1:1.5로 나타났으며, 이는 인간 뇌의 생리학적 범위 내에 있습니다. 이러한 3D 바이오프린팅 세포 집단은 또한 배양 후 7일 이내에 성숙한 신경 세포 유형 마커의 발현과 신경돌기 및 성상세포 돌기의 성장을 보여줍니다. 결과적으로 이 모델은 신경돌기 성장 분석과 함께 세포 염료 및 면역염색 기법을 사용한 분석에 적합합니다. 이러한 생리학적으로 대표되는 모델을 대규모로 생성할 수 있는 능력은 신경 과학 표적에 대한 중간에서 높은 처리량의 스크리닝 분석에 사용하기에 이상적입니다.

Research into central nervous system (CNS) diseases in the drug discovery industry is expanding1. However, many prevalent CNS diseases such as epilepsy, schizophrenia, and Alzheimer&#39;s disease still have no curative treatments2,3,4. The lack of effective therapeutics across CNS diseases can, at least in part, be attributed to a lack of accurate in vitro models of the brain5. This has resulted in a translational gap between current in vitro models and in vivo data and a subsequent bottleneck in research efforts.
Driven by this translational gap, there has been a significant increase in the development of novel 3D cell models within recent years, including neural organoids, neurospheroids, and scaffold-based models6. The 3D structure of these models aids in recapitulating the neural microenvironment, including biomechanical stresses, cell-cell contacts, and the brain extracellular matrix (ECM)7. The brain ECM is a dynamic element of neurophysiology that occupies the space between neural cell types, including neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and the neurovascular unit7. Recapitulation of the brain ECM has been shown to affect neuronal morphology and neuronal firing, and many complex 3D models of the brain have demonstrated deposition of ECM proteins by neural cell types8,9,10,11. Scaffold-based models consist of mature neural cocultures suspended in a porous synthetic or biological hydrogel matrix which represents the brain ECM12. Unlike organoid and spheroid systems, scaffold-based 3D models allow the customization of ECM proteins present and have the added benefit of tunability of hydrogel stiffness to mimic biomechanical stresses13,14.
Although an overwhelming majority of 3D neural models demonstrate an increased recapitulation of the brain microenvironment, not all models are well suited for implementing drug discovery applications15. For a 3D model to be implemented into industrial processes, the system must meet throughput requirements for screening applications and have a relatively short development time16. 3D Bioprinting is a novel technology that offers the potential to create 3D scaffold-based neural models with rapid development time, increased throughput, and higher levels of precision control, alongside the removal of variability caused by human error17. This protocol presents a 3D coculture model of human iPSC-derived glutamatergic neurons and astrocytes in a hydrogel scaffold. This hydrogel scaffold contains physiologically representative bioactive peptides (RGD, IKVAV, YIGSR) and ECM proteins within a mimetic biomechanical stiffness. These full-length ECM proteins include full-length laminin-211 and hyaluronic acid, abundant in the human cortex, with a stiffness of 1.1 kPa in line with in vivo measurements18. This model is designed with practicality for drug discovery, and is&#160;created using a 3D bioprinter in a 96-well or 384-well plate format suitable for screening analysis using imaging techniques with cell dyes and antibodies, alongside neurite outgrowth assays. Cells show expression of neural cell type markers and growth of neurite and astrocytic projections within 7 days of culture. Thus, this protocol will present the methodology to develop a high-throughput 3D neural coculture model for use in drug discovery applications.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg" /> 
Figure 1: Illustrative overview of methodology used to 3D bioprint cocultures. Human iPSC-derived neurons and astrocytes are combined with activator and bioink solutions containing bioactive peptides and are bioprinted to hydrogel scaffolds in 96-well or 384-well formats using drop-on-demand bioprinting technology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: 3D 세포 모델링의 발전 – 신경 공배양을 위한 고처리량 접근 방식 

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

3D cell modeling is a novel field that has exponentially expanded in the past decade. These models have been shown to both facilitate neuronal growth and more accurately represent disease phenotypes. However, we believe there is a shift towards making these models higher throughput and a necessity to embrace automation within development.Traditional methods of developing 3D cultures can be laborious and time-consuming to establish, but 3D bioprinting is a technology that can be applied to scale up these development processes. This technology allows for hundreds of identical models to be created efficiently and without human error. This protocol develops complex cultures because the neural cells are grown in 3D in biologically active hydrogel matrices.But critically, this protocol prioritizes speed and convenience in model development, which can be lacking in this field and can hinder the implementation into industry. This protocol defines a method to establish many 3D cocultures very efficiently with limited input from users. We hope this will remove barriers to using complex cell culture models within high throughput assays and facilitate further investigation of the effect of 3D culture on neural cell types.

신경돌기 성장 분석 이 프로토콜에서는 iPSC 유래 글루타마테르성 뉴런과 성상세포를 3D 바이오프린터를 사용하여 하이드로겔 매트릭스로 공동 배양하여 바이오프린팅했습니다. 프린팅 후 처음 7일 동안 살아있는 세포 현미경을 사용하여 12시간마다 세포를 이미지화했습니다. 바이오프린팅 후, 세포는 둥근 형태를 가져야 하며 하이드로겔 매트릭스 전체에 분산되어야 하며, 배양 후 처음 며칠 동안 돌출부가 거의 없는 더 작은 세포 클러스터를 형성하도록 점진적으로 변화해야 합니다(대표적인 건강한 세포 성장에 대해서는 보충 비디오 1 참조). 4일째가 되면 건강한 세포가 겔 전체로 이동하여 신경돌기 돌출물을 통해 연결된 더 큰 클러스터를 형성합니다. 7일째가 되면 단일 세포가 거의 남지 않고, 신경돌기와 성상세포돌기의 상호 연결된 다발이 강화된 것처럼 보이며, 클러스터에서 형성되는 많은 작은 신경돌기 돌출물을 볼 수 있습니다(그림 2A). 7일간의 성장 기간 동안 촬영한 일련의 살아있는 세포 명시야 이미지를 사용하여 섹션 3에 자세히 설명된 대로 신경돌기 돌출 분석을 수행했습니다. 이 분석은 신경돌기 성장이 12시간에서 156시간 사이에 거의 선형적인 방식(R2 값 = 0.84)으로 증가한다는 것을 보여주었습니다(그림 2B). 이 신경돌기 돌출 기간 동안 세포체 클러스터도 크기가 증가하며( 보충 비디오 1 참조), 이는 하이드로겔 전체의 세포 이동을 나타냅니다.
세포 생존율 및 개체군 비율 이 프로토콜에서는 1,500만 개의 뉴런/mL 및 500만 개의 성상교세포/mL로 구성된 2,000만 개의 세포/mL 농도가 세포 모델의 바이오프린팅에 사용됩니다. calcein-AM(살아있는 세포), ethidium homodimer-1(죽은 세포) 및 핵 염색을 사용한 살아있는 세포 염색을 사용하여 섹션 4(그림 3A)에 따라 7일 동안 생존한 세포 수를 계산할 수 있습니다. 대표 배양에 대한 세포 생존율 결과는 4일차에 나타나며, 전체 세포의 72% ± 1%(평균 ± SEM)가 살아 있고 Calcein-AM에 대한 염색을 보이는 반면, 29% ± 2%(평균 ± SEM) 총 세포는 죽었고 ethidium homodimer-1로 염색되었습니다(그림 3B). Calcein-AM 및 ethidium homodimer-1을 사용한 세포 염색의 대표 이미지는 보충 그림 1 에서 볼 수 있습니다. 죽은 세포는 하이드로겔에 남아 있고 세포 공급 과정에서 제거되지 않기 때문에 3D 배양에 대한 세포 생존 값은 2D 배양과 직접 비교할 수 없습니다.
섹션 5 및 그림 4에 설명된 대로 Β-III 튜불린 및 GFAP에 대한 면역형광 염색을 사용하여 이미지 분석을 수행하여 뉴런과 성상세포 사이의 세포 집단 비율을 결정할 수 있습니다(그림 3A). 대표 배양에서 모델당 총 세포 중 Β-III 튜불린 양성 뉴런은 49% ± 3%(평균 ± SEM)를 나타내는 반면, GFAP 양성 성상교세포는 30% ± 4%(평균 ± SEM)를 나타냅니다. 이것은 각각 1:1.5, 성상교세포(astrocyte)와 뉴런(neuron)의 비율을 제공합니다. 이렇게 하면 모델당 나머지 21%의 총 세포가 남게 되며, 이는 두 세포 마커 모두에 대해 염색되지 않습니다. 세포 생존율 분석 결과 4일째에 세포의 29%의 평균값이 생존할 수 없는 것으로 나타났기 때문에 이러한 세포는 하이드로겔 내에서 죽었을 가능성이 높습니다.
세포 마커의 발현 바이오프린팅된 뉴런 및 성상세포의 형태는 뉴런 세포 유형 마커(Β-III 튜불린) 및 성상세포 마커(GFAP)에 대한 면역염색을 통해 평가되었습니다. 표시된 대표적인 배양에서 면역염색은 개별 세포 유형에 국한되어 건강한 세포 형태를 보여주며, 두 세포 유형 모두 세포 돌출부의 파생물을 나타냅니다(그림 4A,B). 하이드로겔과 세포 구조는 3차원이므로 각 이미지는 그림 4A,B의 구조를 통해 하나의 절편만 나타냅니다. 그림 4C는 하이드로겔 전체에 걸쳐 병합된 이미지 스택을 보여주며, X, Y 및 Z 평면에서 세포 국소화를 보여줍니다. 그림 4D는 Β-III 튜불린에 대한 면역염색만을 보여줍니다. 세포체 클러스터에서 더 미세한 신경돌기 돌출물을 강조합니다. 글루타민성 뉴런의 표현형을 추가로 검사하기 위해 글루타민성 이온 수용체 마커인 GluR2에 대한 면역염색을 수행할 수 있습니다. 그림 4E 내에서 영역 4E.1(삽입)은 신경돌기 다발을 따라 더 높은 분해능의 반점 염색을 보여주기 위해 강조 표시되었습니다. 따라서 이것은 이 공동 배양의 뉴런이 글루타마테르성 표현형을 가지고 있음을 확인합니다. 모든 면역염색 이미지에서 세포 클러스터와 신경돌기 주변에서 면역형광 염색된 비세포 구조를 관찰할 수 있습니다. 이러한 구조는 하이드로겔에 결합하는 소량의 비특이적 항체와 함께 하이드로겔 내에 잔류된 파편을 나타낼 가능성이 높습니다. 이는 바이오프린팅 배양에서 예상되는데, 3D 스캐폴드 모델 내에서 세포 공급 중에 죽은 세포와 파편이 제거되지 않기 때문입니다. 대표적인 음성 대조군 면역염색 이미지는 2차 항체의 하이드로겔 비특이적 결합을 설명하기 위해 보충 그림 2에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig02.jpg"> 그림 2: Glutamatergic 뉴런과 성상세포는 바이오프린터를 사용하여 하이드로겔 매트릭스에 바이오프린팅되었으며 명시야 현미경을 사용하여 12시간마다 이미지화되었습니다 . (A) 분석 중 세포 배양에서 촬영한 명시야 이미지의 예. 이미지는 156시간 시점을 나타내고 눈금 막대는 400μm를 나타냅니다. (B) ImageJ용 NeuronJ 패키지를 사용하여 측정한 배양물에서 신경 돌기 돌출물의 평균 길이(μm). 각 데이터 포인트는 n = 3개의 신경돌기이며 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig03v2.jpg"> 그림 3: 2,000만 cells/mL의 활성제 용액 농도가 세포 모델의 바이오프린팅에 사용되었습니다 . (A) 세포 생존율은 살아있는/죽은 세포 염료(각각 Calcein-AM 및 ethidium homodimer-1)를 사용하여 계산되었습니다. 값은 웰당 총 세포의 72% ± 1%(평균 ± SEM, n = 3)가 살아 있고 세포의 29%± 2%(평균 ± SEM, n = 3)가 4일째에 웰당 총 세포 개체군에서 죽었음을 보여줍니다. 표시된 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. (B) 웰당 뉴런 및 성상세포의 세포 집단 비율은 그림 4에 표시된 염색의 이미지 분석을 통해 계산되었습니다. 뉴런은 7일째에 Β-III 튜불린에 대해 양성으로 염색된 세포의 비율(49% ± 3%, 평균 ± SEM, n = 3)을 나타내는 반면, 성상교세포는 7일째에 GFAP에 대해 양성으로 염색된 세포의 비율을 나타냅니다(30% ± 4%, 평균 ± SEM, n = 3). 표시된 값은 SEM± 평균을 나타냅니다. 그림 3 에 표시된 계산을 위한 모든 이미징은 컨포칼 이미징 시스템에서 수행되었으며 모든 분석은 방법에 따라 이미지 분석 플랫폼과 GraphPad Prism에서 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig04.jpg"> 그림 4: 7일째 glutamatergic 뉴런 및 성상교세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양에서 신경 세포 유형 마커의 발현. (A,B) 도립 현미경 플랫폼에서 10배 배율로 이미지화한 신경 마커 Β-III 튜불린 및 성상세포 마커 GFAP의 면역형광 염색. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. (C) Hoechst와 함께 염색된 신경 마커 β-III 튜불린 및 성상세포 마커 GFAP의 면역형광 염색(XYZ 평면도에 표시됨, 10배 배율로 컨포칼 이미징 시스템에서 이미지화). 이미지 분석 플랫폼에서 생성됩니다. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. (D) Hoechst와 함께 염색된 신경 마커 β-III 튜불린의 면역형광 염색, 20배 배율로 컨포칼 이미징 시스템에서 이미지화. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. (E) Hoechst와 함께 염색된 글루타마테르성 마커 GluR2의 면역형광 염색, 도립 현미경 플랫폼에서 10배 배율로 이미지화. 상자 3E.1은 GluR2 염색의 강조 표시된 영역을 보여줍니다. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 동영상 1: Glutamatergic 뉴런 및 성상세포는 바이오프린터를 사용하여 하이드로겔 매트릭스에 바이오프린팅되었으며 명시야 현미경을 사용하여 12시간마다 이미징되었습니다. 분석 중 세포 배양에서 촬영한 명시야 이미지 비디오, 오른쪽 하단 모서리에 시점이 표시되며 스케일 막대는 400μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 4일차에 바이오프린팅된 뉴런 및 성상세포의 살아있는/죽은 분석의 예 이미지. Calcein-AM 염색은 녹색(488nm)으로 표시되고 ethidium homodimer 염색은 빨간색(647nm)으로 표시됩니다. 이미지는 이미지 분석 플랫폼에서 생성된 XYZ 평면 뷰에 표시됩니다 . 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. (A) 이미징은 4배 배율의 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 수행되었습니다. (B) 이미징은 10x 배율에서 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 면역형광 염색 후 음성 대조군 이미지의 예. 1차 항체는 생략하고, 면역염색 프로토콜에 따라 녹색(488nm) 및 적색(647nm) 2차 항체를 사용하였다. 이미지는 이미지 분석 플랫폼에서 생성된 XYZ 평면 뷰에 표시됩니다. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. 이미징은 10x 배율의 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing 3D Cell Modeling – A High-Throughput Approach for Neural Cocultures at JoVE.com

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development ...

3D 세포 모델링은 지난 10년 동안 기하급수적으로 확장된 새로운 분야입니다. 이러한 모델은 신경 세포의 성장을 촉진하고 질병 표현형을 보다 정확하게 나타내는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 모델을 더 높은 처리량으로 만드는 방향으로 전환하고 개발 내에서 자동화를 수용해야 할 필요성이 있다고 생각합니다.3D 배양을 개발하는 전통적인 방법은 확립하는 데 힘들고 시간이 많이 소요될 수 있지만 3D 바이오프린팅은 이러한 개발 프로세스를 확장하는 데 적용할 수 있는 기술입니다. 이 기술을 사용하면 수백 개의 동일한 모델을 인적 오류 없이 효율적으로 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경 세포가 생물학적으로 활성화된 하이드로겔 매트릭스에서 3D로 성장하기 때문에 복잡한 배양을 개발합니다.그러나 결정적으로 이 프로토콜은 모델 개발의 속도와 편의성을 우선시하는데, 이는 이 분야에서 부족할 수 있으며 산업으로의 구현을 방해할 수 있습니다. 이 프로토콜은 사용자의 제한된 입력으로 많은 3D 공동 배양을 매우 효율적으로 설정하는 방법을 정의합니다. 이를 통해 고처리량 분석 내에서 복잡한 세포 배양 모델을 사용하는 데 대한 장벽을 제거하고 신경 세포 유형에 대한 3D 배양의 효과에 대한 추가 조사를 촉진할 수 있기를 바랍니다.

three-dimensional-bioprinting-human-ipsc-derived-neuron-astrocyte

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

3.3K 조회수.  MSD Research Laboratories, London, UK. 3D 세포 모델링은 지난 10년 동안 기하급수적으로 확장된 새로운 분야입니다. 이러한 모델은 신경 세포의 성장을 촉진하고 질병 표현형을 보다 정확하게 나타내는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 모델을 더 높은 처리량으로 만드는 방향으로 전환하고 개발 내에서 자동화를 수용해야 할 필요성이 있다고 생각합니다.3D 배양을 개발하는 전통적인 방법은 확립하는 데 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 3D 세포 모델링의 발전 – 신경 공배양을 위한 고처리량 접근 방식 

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development time. However, many published 3D models&#160;do not satisfy these criteria. This therefore, limits their usefulness in early drug discovery applications. Three-dimensional (3D) bioprinting is a novel technology that can be applied to the development of 3D models to expedite development time, increase standardization, and increase throughput. Here, we present a protocol to develop 3D bioprinted coculture models of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived glutamatergic neurons and astrocytes. These cocultures are embedded within a hydrogel matrix of bioactive peptides, full-length extracellular matrix (ECM) proteins, and with a physiological stiffness of 1.1 kPa. The model can be rapidly established in 96-well and 384-well formats and produces an average post-print viability of 72%. The astrocyte-to-neuron ratio in this model is shown to be 1:1.5, which is within the physiological range for the human brain. These 3D bioprinted cell populations also show expression of mature neural cell type markers and growth of neurite and astrocyte projections within 7 days of culture. As a result, this model is suitable for analysis using cell dyes and immunostaining techniques alongside neurite outgrowth assays. The ability to produce these physiologically representative models at scale makes them ideal for use in medium-to-high throughput screening assays for neuroscience targets.

Here, we present a protocol to produce 3D-bioprinted cocultures of iPSC-derived neurons and astrocytes. This coculture model, generated within a hydrogel scaffold in 96- or 384-well formats, demonstrates high post-print viability and neurite outgrowth within 7 days and shows the expression of maturity markers for both cell types.

연구

신경과학

Generating Plate Map and Coating of 2D Control on Plastic Wells for 3D Bioprinting of Human iPSC-Derived Cells

To begin open the plate map software and select the culture cells in the 3D option. Then, select imaging model for 96 well plates. In the matrix selection window, select HydroGel PX-2.53.Enter the cell types as glutamatergic neurons and astrocytes, and cell density as 20 million cells per milliliter. Design the desired plate map by highlighting wells on the plate. Include at least one row of 2D control on plastic in the design.Then, verify that the plate model listed at the top of the window is changed to the intended plate model for use. Using the Download buttons, download the protocol and print file for the plate map. Then, save them to the bio printer-linked computer.Prepare a 0.1%polyethylenimine solution in a borate buffer and filter it through a 0.22-micron filter. Add 100 microliters of 0.1%polyethylenimine solution to each 2D control well of a 96-well plate, and incubate at 37 degrees Celsius for two hours. Then, rinse the wells five times with PBS.Once the wells are dried, add diluted laminin solution into the wells and incubate at 37 degrees Celsius for four hours.

인간 iPSC 유래 세포의 3D 바이오프린팅을 위한 플라스틱 웰의 2D 제어 플레이트 맵 생성 및 코팅

3D Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures

To begin, maintain sterility by cleaning gloves, cartridges, and culture plates with 70%ethanol. Next, switch on the compressor for the bioprinter and select the initialized button to initialize the printer. Wipe down surfaces inside the printer with 70%ethanol.Using the Print Run button, load the print file and open the Print Protocol PDF. Thaw bioink, activator fluids, and 50 milliliters of complete media at room temperature. Prepare the printing cartridge as instructed in the Print Protocol PDF, ensuring the correct volumes of reagents in specified compartments.Next, add 1.2 milliliters of F3 to C1, 1.2 milliliters of F32 to C2, and 200 microliters of F261 to C4.Remove the polyethylenimine and laminin coated plate from the incubator. Set the plate holder compartment to a low profile plate. Insert the plate in the right hand plate holder compartment of the printer.Remove the lid from the plate and place it in the lid holder. Place the print cartridge into the bioprinter and select the Print Inert Base button to start the print run. After thawing, centrifuge the glutamatergic neurons and astrocytes, aspirate the supernatant and resuspend both cell types separately in one milliliter of complete media.Mix 20 microliters of the cell suspension with the same volume of trypan blue and count the cells to determine viable cell concentration for each cell type. Next, combine 3 million glutamatergic neurons with 1 million astrocytes in a 15 milliliter tube, and add complete media to make a final volume of eight milliliters. Centrifuge the cell suspension and aspirate the supernatant without disturbing the pellet.Suspend the pellet in 200 microliters of activator fluid F299 by pipetting up and down. Place the lids on the cartridge and culture plate, and remove them from the bioprinter. In a biosafety cabinet, add 200 microliters of cell suspension to well C3 of the print cartridge.Reinsert the cartridge into the bioprinter and remove the lid as demonstrated previously. Initiate the print models stage of the print run. Concurrently, replace the laminate media from the 2D control plate with complete media.Insert the bioprinting targeting plate into the bioprinter and remove the lid. Begin the bioprint targeting process. When prompted, remove the targeting plate from the bioprinter.Use the guide to identify locations where droplets can be observed on the plate. Reinsert the targeting plate into the bioprinter to repeat the droplet printing and selection process. When prompted, replace the targeting plate with a cell culture plate.After printing, add complete media to all 3D co-culture wells, and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Finally, dispose of cartridges and remaining liquids. according to lab protocols.After seven days of printing, almost no single cells remained and interconnecting bundles of neurites and astrocytic projections appeared fortified. Neurite outgrowth increased linearly between 12 to 156 hours. During neurite outgrowth, cell body clusters also increased in size.Cell viability analysis showed that approximately 72%of total cells were live on day four while 29%were dead. Immunostaining confirmed the healthy cell morphology of the bioprinted neurons and astrocytes with both cell types exhibiting outgrowth of cellular protrusions. The glutamatergic phenotype of the neurons was confirmed through immunostaining for glutamate receptor 2.