Dual-Reporter IgG and IgM Serological Assay for Simultaneous Antibody Detection of Borrelia

96웰 플레이트에서 5마이크로리터의 혈청 샘플과 120마이크로리터의 분석 완충액을 혼합하여 인간 혈청 샘플 희석을 시작합니다. 초기 희석액 10마이크로리터와 70마이크로리터의 분석 완충액을 혼합하여 추가로 8배로 희석합니다. 이제 표적 항원 결합 비드를 포함하는 비드 혼합물 100마이크로리터를 준비합니다.

다음으로, 준비된 비드 혼합물을 Falcon 튜브의 분석 완충액 2.4ml에 희석합니다. 25 마이크로리터의 비드 현탁액을 지정된 웰에 피펫팅하여 혈청 배양을 시작합니다. 25마이크로리터의 200배 희석된 혈청을 비드 현탁액이 있는 웰에 추가합니다.

96웰 반응 플레이트를 마이크로플레이트 씰로 덮습니다. 그런 다음 접시 셰이커에 구슬로 접시를 배양합니다. 배양 후 플레이트 셰이커에서 96웰 반응 플레이트를 제거합니다.

플레이트를 마그네틱 플레이트 와셔에 넣고 접착 플레이트 씰을 제거합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 비드를 세 번 세척한 다음 마지막 세척 단계 후 비드에서 최종 세척량을 흡인합니다. 첫 번째 항체 배양의 경우 분석 완충액에서 새로운 IgG 및 IgM 이중 검출 시약 혼합물을 준비하는 것으로 시작합니다.

검출 시약 30마이크로리터를 지정된 각 웰에 피펫팅한 다음 96웰 반응 플레이트를 마이크로플레이트 씰로 덮습니다. 접시 셰이커에서 접시를 섭씨 20도에서 분당 750회 회전으로 45분 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 마그네틱 플레이트 와셔에 넣고 이전과 같이 플레이트를 세척한 후 각 반응에 희석된 BV421 표지된 스트립타비딘 30마이크로리터를 접착판 밀봉 피펫을 제거합니다.

그런 다음 후속 배양을 위해 밀봉된 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓습니다. 배양이 완료되면 플레이트를 세척하고 세척 버퍼를 사용하여 웰 내의 비드를 최종 부피 100마이크로리터까지 재현탁합니다. 결과를 분석하려면 96웰 반응 플레이트를 마이크로플레이트 씰로 덮습니다.

다음으로, 접시 셰이커에서 분당 1000 회전으로 섭씨 20도에서 3 분 동안 덮인 접시를 배양합니다. Shaker에서 듀얼 리포터 유량 분석기 기기로 플레이트를 옮깁니다. 마지막으로, 제조업체의 지침에 따라 샘플 중간 형광 강도 또는 MFI를 평가합니다.

3개의 대표적인 보렐리아 항원에 대한 스피어만 상관 분석은 인간 혈청에 존재하는 항 보렐리아 항체를 검출할 때 MFI 값의 균일한 재현성을 입증했습니다. 이중 리포터 분석은 Levey-Jennings 차트에 의해 입증된 높은 분석 간 정밀도로 우수한 분석 간 재현성을 보여주었습니다. 100배에서 12, 800배의 시료 희석에서 IgM 검출 및 IgG 검출에 대한 희석 곡선은 두 기기 모두에서 유사했습니다.

MFI 값은 단일 리포터 기기에서 약간 더 높았습니다.