해리된 내피 세포, 기생충 및 성상교세포를 사용하여 인간 만능 줄기 세포 유래 혈액-뇌 장벽(iBBB)을 조립하고, 피펫팅 오류를 설명하기 위해 계산된 세포 수보다 10% 더 많은 세포를 포함하면서 원뿔형 튜브에 세 가지 유형의 세포를 결합합니다. 300g에서 3분 동안 세포 혼합물을 회전시킵니다. 상층액을 흡인하여 세포 펠릿에 약 50 마이크로리터의 배지를 남깁니다.
P200 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 잔류 배지에 부드럽게 재현탁시켜 단일 세포 슬러리를 만듭니다. 결과 셀 슬러리가 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓고 원하는 iBBB 수에 따라 충분한 양의 환원 된 GF Basement Membrane Matrix를 추가합니다. 기포가 생기지 않도록 세포를 균질하게 혼합합니다.
생성된 세포 매트릭스 혼합물 50마이크로리터를 48웰 또는 96웰 유리 바닥 배양 접시의 웰에 피펫팅하고 접시 바닥 전체에 고르게 분포시킵니다. 접시를 섭씨 37도에서 30-40분 동안 배양하여 세포를 캡슐화하면서 매트릭스를 중합합니다. 마지막으로, 500 마이크로리터의 보충된 성상교세포 배지를 웰에 추가하고 배양 중인 iBBB를 유지합니다.
96웰 플레이트의 경우, 일반적으로 2주가 소요되는 다운스트림 분석을 위해 충분히 개발될 때까지 100-150마이크로리터의 배지를 웰에 추가합니다. 적절하게 형성된 iBBB는 명시야 현미경에서 응고된 단일 반투명 디스크로 나타났습니다. 24시간 후, 균등하게 분포된 단일 세포가 확인되었습니다.
2주 후, 정의하기는 어렵지만 더 뚜렷한 구조가 보였다.