시작하려면 가위를 사용하여 작은 렌즈 종이를 잘라 페트리 접시에 넣으십시오. 다음으로, 쥐에서 분리한 고정된 뇌와 척추를 담은 포르말린을 여과지를 깐 깔때기에 붓습니다. 뇌와 척추를 빈 페트리 접시로 옮깁니다.
메스를 사용하여 뇌를 6개의 관상 조각으로 나눕니다. 집게를 사용하여 뇌 표본을 페트리 접시에 있는 렌즈 종이의 절반에 옮깁니다. 메스를 사용하여 척수를 세 조각으로 자른 다음 꼬리 끝에서 척수가 보일 때까지 천골 척추 조각을 자릅니다.
주로 사용하지 않는 손으로 흉추를 집어 듭니다. 주로 사용하는 손으로 치아를 단단히 닫은 Adson 집게를 잡고 부드럽게 비틀면서 끝을 척추의 작은 구멍으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 컬럼에서 나오는 척수를 부드럽게 당겨 렌즈 종이가 들어 있는 페트리 접시에 코드 조각을 놓습니다.
메스를 사용하여 세 개의 척수 조각을 더 작은 단면 조각으로 나눕니다. 뇌 조각이 들어있는 렌즈 종이의 같은 절반에 이 조각들을 배열하십시오. 렌즈 종이를 접어 티슈 조각을 끼우고 라벨이 붙은 카세트에 넣습니다.
카세트를 포르말린이 들어 있는 표본 항아리에 옮깁니다. 배양 후 검체 용기의 카세트를 자동 조직 처리기의 첫 번째 포르말린 수조로 옮기고 밤새 처리기를 실행합니다. 다음날 티슈 프로세서에서 카세트를 꺼내 파라핀 임베딩 스테이션의 따뜻한 보관실로 옮기고 파라핀 왁스를 부어 금형 바닥을 덮습니다.
미세한 집게를 사용하여 뇌 관상동맥 및 척수 단면 조각을 금형 바닥의 파라핀에 넣습니다. 금형을 냉각 표면으로 몇 초 동안 옮겨 뇌와 표본을 제자리에 고정합니다. 금형을 가열된 표면으로 다시 옮기고 뜨거운 파라핀으로 상단까지 채웁니다.
시편 ID로 라벨이 붙은 카세트 뚜껑을 금형에 놓습니다. 카세트 덮개 위에 파라핀을 붓습니다. 왁스가 굳을 수 있도록 금형을 냉각 스테이션으로 옮깁니다.
블록이 완전히 식으면 회전식 마이크로톰에 블록을 고정합니다. 블록을 자르고 각 파라핀 블록의 5마이크로미터 섹션을 자릅니다. 파라핀 리본을 섭씨 42도의 수조로 옮깁니다.
수조의 단면을 라벨이 붙은 슬라이드로 모으십시오. 슬라이드를 플라스틱 슬라이드 랙에 놓고 건조 오븐에서 섭씨 37도에서 밤새 섹션을 굽습니다. 스캔 후 이미지 J를 연 다음 분석을 위해 섹션의 tiff 이미지를 끌어다 놓습니다.
4개의 사분면에서 척수 절편을 관찰하고 각 사분면에 탈수초화 병변의 존재 여부에 대한 점수를 매깁니다. 이 섹션은 4개의 사분면 모두에 병변이 있기 때문에 점수가 4입니다. 이 섹션은 병변이 하나의 사분면에만 있기 때문에 1점을 얻습니다.
CD45 염색은 병변에 백혈구가 있음을 나타냅니다. 새로운 병변은 오래된 병변에 비해 많은 CD45 세포를 포함합니다. 대조적으로, 새로운 병변은 오래된 병변에 비해 SMI-32 양성 축삭돌기가 더 적을 수 있습니다.
야생형 그룹의 마우스는 완전한 마비와 함께 심각한 EAE를 개발했습니다. OGR1-KO 그룹은 경증 질환을 앓았습니다. 이러한 임상 점수의 차이는 척수에서 염색된 미엘린 면적의 수막하 탈수초화 병변의 변화와 일치했으며, 또한 미엘린 분율 비율은 OGR1과 야생형 마우스 간에 유의하게 달랐으며 누적 EAE 점수와 상관관계가 있었습니다.
EAE에서 뇌의 염증은 주로 소뇌와 뇌간에 국한됩니다. 뇌수막, 심실 근처, 시신경 및 뇌량과 같은 다른 백질 흔적을 포함한 뇌에서 염증의 추가 영역이 분명할 수 있습니다. 소분자 어레이 분석으로 측정한 혈청 신경필라멘트 광은 건강한 생쥐에 비해 EAE가 있는 생쥐에서 더 높은 혈청 신경필라멘트 광 수준을 감지했으며 이러한 상승된 수치는 척수에서 SMI-32 양성의 밀도와 상관관계가 있었습니다.
