먼저 마취된 쥐를 사용하여 1% 트로피카미드와 2.5% 페닐에프린을 눈에 한 방울 떨어뜨려 동공을 확장시킵니다. 그런 다음 각막에 안과 젤을 바르면 건조함과 마취로 인한 백내장을 예방할 수 있습니다. 다음으로, 망막하 주사를 수행하기 위해 멸균 환경에서 직사광선 경로가 있는 정립 작동 현미경을 설정합니다.
10마이크로리터 유리 주사기를 준비하려면 바늘 허브를 분리하고 33게이지 뭉툭한 바늘을 부착합니다. 금속 허브 커버를 잡고 바늘을 주사기에 단단히 고정합니다. 누출 및 바늘 개통을 테스트하기 위해 증류수로 바늘을 씻어냅니다.
그런 다음 주사기를 비우고 조심스럽게 따로 보관하십시오. 그런 다음 마취된 마우스를 쿠션에 놓고 치료 눈을 현미경의 대물렌즈 쪽으로 향하게 합니다. 0.5%프로파라카인 염산염을 바르고 30초 동안 기다립니다.
그런 다음 150 마이크로리터의 안과 젤을 눈에 바르고 둥근 커버 슬립을 부착합니다. 각막, 홍채, 동공, 수정체 및 결막을 관찰하는 예비 눈 검사를 수행합니다. 초점면을 조정하여 동공을 통해 쥐 눈의 안저를 시각화합니다.
그런 다음 시신경 헤드가 동공의 중심과 정렬되도록 헤드를 정렬합니다. 그런 다음 HESC 유래 광수용체 전구세포가 포함된 튜브의 바닥을 두드려 균일한 세포 현탁액을 얻습니다. 10 마이크로리터 유리 마이크로리터 주사기에 33 게이지 뭉툭한 바늘을 사용하여 2마이크로리터의 세포 혼합물을 그립니다.
30게이지 일회용 바늘을 사용하여 변연계 2mm 뒤에 있는 절제술 상처를 만듭니다. 렌즈와의 접촉을 방지하기 위해 바늘의 각도를 약 45도로 유지하십시오. 바늘 끝이 눈 안에 보이면 바늘을 조심스럽게 집어넣습니다.
바늘에 찔려 부상을 방지하기 위해 사용한 바늘을 날카로운 통에 버리십시오. 이제 유리 주사기를 가지고 뭉툭한 바늘을 절제술 상처에 삽입합니다. 뭉툭한 바늘이 입구 상처의 반대쪽 망막에 도달할 때까지 수정체를 건드리지 않고 전진시킵니다.
공막의 압력 가지가 보일 때까지 망막을 부드럽게 관통합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 세포 현탁액 또는 PRDM 배지를 주사기에 부드러운 압력을 유지하면서 망막하 공간에 주입합니다. 눈에 보이는 블레브의 형성은 성공적인 주입을 나타냅니다.
세포가 안정될 때까지 10초 동안 기다립니다. 눈에서 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 블렙을 시각화하려면 마우스 헤드를 움직여 현미경 아래에 눈의 위치를 지정하고 헤드를 부드럽게 잡아 위치를 고정합니다.
수술 중 OCT의 경우 수술 현미경의 IOCT 기능을 사용하고 OCT 화면에서 큐브를 선택합니다. 화살표 버튼을 눌러 블렙에 스캔 영역을 배치합니다. 최상의 OCT 품질을 위해 OCT, 슬라이드 센터링 및 초점을 조정하려면 캡처 또는 스캔을 눌러 블렙 영역의 OCT 스캔을 획득하고 이미지를 검토하여 스캔 품질을 확인합니다.
마지막으로 커버 슬립을 제거하고 거즈를 사용하여 눈에서 젤을 부드럽게 닦아냅니다. 감염을 예방하기 위해 주사 후 한 번 항생제 연고를 투여하십시오. OCT 스캔은 세포 처리된 눈에 현탁된 뚜렷한 HESC 개체를 발견했습니다.
대조적으로, 매체를 처리한 눈은 망막하 공간 내에 세포가 없는 흐려지지 않은 액체를 나타냈습니다.
