시작하려면 피복 유체 탱크에 있는 탈이온수 6리터에 염화나트륨 30g을 넣고 탱크를 흔들어 소금을 녹입니다. 그런 다음 탱크를 세포 분류기에 연결합니다. 셀 분류기를 켜고 유체 시스템을 시작한 다음 유체가 평형을 이룰 때까지 기다립니다.
드롭 지연을 설정합니다. 효모 추출물 원액을 제조하려면 탄소 13 효모 추출물 1 분취액을 초순수 7.5 밀리리터와 메탄올 2.5 밀리리터에 재현탁시킵니다. 그런 다음 추출 완충액을 제조하기 위해 10 마이크로 리터의 탄소 13 효모 추출물 원액을 10 밀리리터의 아세토 니트릴에 첨가하고 잘 혼합합니다.
25 마이크로리터의 추출 버퍼를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 추가하고 웰을 뚜껑으로 덮습니다. 분류된 세포를 수집하기 위해 세포 분류기에 플레이트를 놓습니다. Alexa Fluor 647 양성 및 PE 음성 모집단에 대해 각각 5,000개의 이벤트를 처음 4개의 웰로 정렬합니다.
그런 다음 PE 양성 및 Alexa Fluor 647 음성 모집단에 대해 각각 5,000개의 이벤트를 다음 4개의 웰로 정렬합니다. 다음으로, 조혈모세포의 경우, PE-Cy7 낮음, PE 양성, APC-Cy7 양성, 브릴리언트 바이올렛 605 양성 및 브릴리언트 바이올렛 421 음성 집단 5000개를 첫 번째 웰로 분류한 다음 PE-Cy7 낮음, PE 양성, APC-Cy7 양성, 브릴리언트 바이올렛 421 양성 및 브릴리언트 바이올렛 605 음성 집단 5000개를 다음 웰로 분류합니다. 파편 샘플의 경우, 너무 작아서 전방 및 측면 산란 신호를 기반으로 온전한 세포를 표현할 수 없는 이벤트를 선택합니다.
그런 다음 LC-MS 기기를 켭니다. 놓으십시오amp기기의 자동 샘플러에 샘플 플레이트. LC-MS 호환 소프트웨어를 열고 분석을 위해 기기를 준비합니다.
최소 4개의 공정 블랭크 또는 풀 샘플을 실행하여 컬럼을 평형화하고 LC 테스트 혼합물을 실행하여 크로마토그래피 성능을 확인합니다. 초기 및 최대 배압이 각각 150bar 및 400bar 미만인지 확인합니다. 그런 다음 보존 시간이 1분 이내인지 확인합니다.
다음으로, 양의 132에서 86 전이에서 류신과 이소류신 사이의 밸리가 피크 높이의 20% 미만인지 확인합니다. 마지막으로, AMP와 ADP의 머무름 시간 차이가 1.5 - 1.9분이고 ADP와 ATP의 차이가 1.1 - 1.5분인지 확인합니다. 실험 매개변수를 확인한 후 공정 블랭크 또는 풀 샘플로 실행을 설정하여 LC 테스트 믹스의 캐리오버를 최소화한 다음 테스트 샘플을 무작위 순서로 설정합니다.
FACS 분류를 통해 동일한 세포 현탁액에서 서로 다른 세포 유형의 순수 집단을 분리할 수 있습니다. 동일한 조직의 세포 유형 간의 대사 차이는 조혈 줄기 및 다분화능 전구 세포에 대한 FACS 세포 CMS 프로토콜을 사용하여 보존되었습니다. 6마리의 쥐에서 채취한 세포는 6개의 샘플을 생성해야 했으며, 이는 동일한 쥐 비장에서 분류된 B 및 T 세포에 비해 각 그룹 내에서 더 큰 변동성을 초래했습니다.
공정 블랭크 대조군 시료를 나타내는 파편 시료는 세포 추출물을 함유하는 시료로부터 명확하게 분리되었습니다. 다양한 세포 유형에 걸친 대사 산물의 상대적 수준에 대한 정보를 보여주는 히트 맵이 여기에 표시됩니다.
