In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

시작하려면 PBS로 24 웰 플레이트의 상부 챔버를 헹굽니다. 와류 믹서를 사용하여 BEND3 셀을 DMEM 배지와 혼합하여 현탁액을 만듭니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 상부 챔버에 있는 PET 멤브레인에 200마이크로리터의 BEND3 셀 현탁액을 파종합니다.

1개, 200 완전한 매체의 위 및 더 낮은 약실의 삼투압을 안정시키기 위하여 격판덮개의 더 낮은 약실에 추가하십시오. 음압 피펫으로 한쪽에서 기존 배지를 천천히 제거하고 유체 교환 중에 벽을 따라 새 배지를 추가하여 배지를 교체합니다. TEER을 측정하기 전에 저항기, 5% 차아염소산나트륨 용액, 75% 에탄올 및 이중 증류수를 매우 깨끗한 테이블에 놓습니다.

잔류 박테리아와 병원균을 제거하기 위해 30분 동안 UV 조사를 켭니다. 전극을 5% 차아염소산나트륨 용액에 넣고 3-5초 동안 천천히 흔듭니다. 그런 다음 75% 에탄올에 15분 동안 담그십시오.

마지막으로 사용할 때까지 PBS 또는 이중 증류수로 옮깁니다. 그런 다음 셀 저항 미터 뒷면에 있는 스위치를 켭니다. 플레이트 선택(Select Plate)을 클릭하고 24웰 플레이트를 선택합니다.

작업에 따라 적절한 감지 순서를 선택하십시오. 킬로옴 저항을 오른쪽 플러그에 삽입하여 기기를 보정합니다. 교정 결과가 1000 플러스 마이너스 5옴이면 기기가 정확한 것으로 간주하십시오.

그렇지 않은 경우 기본 인터페이스에서 Mode Units(모드 단위)를 클릭하여 Ohms(옴)를 선택한 다음 Calibrate(보정)를 클릭합니다. 그런 다음 킬로 옴 저항을 제거하고 연결 와이어를 사용하여 측정 전극으로 교체합니다. 전극을 매체만 들어 있는 24웰 플레이트에 수직으로 놓고 기기에서 Blank Handling을 클릭합니다.

안착된 셀이 없는 플레이트 저항의 배경 값은 약 134.4옴이어야 합니다. 다음으로, 두 개의 전극을 시트 플레이트의 상부 및 하부 챔버에 삽입하여 셀층이 그 사이에 있도록 합니다. 페달을 부드럽게 밟아 저항 값을 기록하십시오.

전극이 상부 챔버의 셀과 하부 챔버의 바닥에 닿지 않도록 하십시오. 방정식에 표시된 대로 전기 저항 값과 상부 챔버의 바닥 영역을 곱하여 TEER 값을 얻습니다. TEER 대 시간(일)의 선 플롯을 그립니다.

저항 값이 시간이 지남에 따라 증가하지 않으면 세포가 장벽을 형성합니다. BEND3 세포에 대해 시간 대비 표시된 저항 값은 세포 TEER 값이 5일째에 안정화되기 시작했음을 보여주었습니다.