매우 깨끗한 작업대에서 멸균 조건에서 작업하는 동안 변연 틈새 세포(LNC)의 분리를 수행합니다. 중간 용어 각막 저장 배지에서 변연 조직을 검색합니다. 멸균 수술용 원형 칼날을 사용하여 각막 주변의 홍채와 내피를 긁어 제거합니다.
그런 다음 멸균 수술용 원형 칼날을 사용하여 변막 조직을 12등분으로 자르고 각막과 공막의 양쪽에 1mm의 조직만 남깁니다. 그 후, 12 개의 림버스 조직 조각을 35mm 배양 플레이트에 옮기고 콜라겐 분해 효소 A 1 밀리리터를 첨가하여 조직을 플레이트에 완전히 담그십시오. 섭씨 37도의 세포 인큐베이터에서 18시간 동안 배양판을 배양하여 조직을 소화합니다.
섭씨 4도로 설정된 냉장고에서 마트리겔 또는 기저막 매트릭스를 해동합니다. 200마이크로리터 및 1밀리리터 팁이 들어 있는 멸균 백, 15밀리리터 원심분리기 튜브, 6웰 플레이트를 준비하고 백을 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도에서 20분 동안 둡니다. 냉각기에서 팁, 원심 분리기 튜브 및 6 개의 웰 플레이트를 회수 한 후 매우 깨끗한 작업대에서 다음 단계를 수행합니다.
미리 냉각된 200마이크로리터 팁을 사용하여 해동된 기저막 매트릭스 50마이크로리터를 1밀리리터의 MESCM에 피펫팅하고 부드럽게 혼합합니다. 피펫에 장착된 사전 냉각된 1mL 팁을 사용하여 생성된 5% 기저 멤브레인 매트릭스를 사전 냉각된 6웰 배양 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 6웰 플레이트를 수평으로 부드럽게 흔든 후 섭씨 37도의 인큐베이터에 약 1시간 동안 넣어 5% 마트리겔 코팅 배양 플레이트를 준비합니다.
18시간 소화 후 콜라겐분해효소 A가 소화된 변부 조직을 회수하는데, 대부분 눈에 보이는 작은 클러스터가 포함되어 있습니다. 실체 현미경으로 작업하면서 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 소화되지 않은 공막 조직에서 클러스터를 분리합니다. 분리된 클러스터를 35mm 배양 플레이트에 0.25%트립신-EDTA에 담그고 플레이트를 15분 동안 배양합니다.
그런 다음 10% 녹아웃 세럼이 포함된 MESCM 1mL를 플레이트에 추가하여 세포 분해를 촉진합니다. 1mL 피펫 팁으로 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 클러스터를 개별 셀로 나눕니다. 셀 현탁액을 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 200G로 원심분리합니다.
세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 1ml의 MESCM을 추가하여 세포를 재현탁시킵니다. 1 밀리리터 피펫 팁을 사용하여 내용물을 위아래로 2-3회 피펫팅하여 전체 펠릿이 MESCM에 재현탁되도록 합니다. 세포 계수를 위해 현탁액에서 20마이크로리터를 수집합니다.
다음으로, 1 밀리리터 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 5 % 기저 멤브레인 매트릭스 코팅 된 6 웰 플레이트로 옮깁니다. MESCM을 추가하여 우물의 총 부피를 2.5밀리리터로 만듭니다. 세포가 균일하게 분포되도록 6웰 플레이트를 수평으로 부드럽게 흔듭니다.
세포를 이미징한 후 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 시연된 프로토콜은 각막 공막 테두리 조직을 성공적으로 소화하여 현미경으로 시각화할 수 있는 클러스터를 생성했습니다. 예상대로 송이는 애벌레 모양과 비슷했습니다.
1차 LNC는 천천히 성장하여 배양에 약 12일이 걸렸습니다. 1번 항에서 8번 항까지의 LNC는 통과하는 데 약 3일이 걸렸지만, 9번 항 이후 LNC의 성장률은 크게 감소했습니다. 형태학적으로 LNC는 방추형 모양이었고 통로 0이 둥글었다.
통로 3 이후에는 균일 한 크기의 방추형이었습니다. 세포 더블링 수(NCD)는 LNC의 성장률을 나타냅니다. NCD와 누적 NCD 곡선은 LNC가 3번 통로에서 5번 통로로 가장 빠르게 성장했음을 보여주었습니다.
