면역형광 염색으로 변연 틈새 세포 또는 LNC를 식별하려면 5% matrigel 코팅 6웰 플레이트에서 배양된 LNC에 웰당 0.25%트립신 EDTA 1mL를 추가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 접시를 배양하여 세포를 소화합니다. MESCM이 함유된 녹아웃 혈청 1mL를 세포 현탁액에 첨가하여 소화를 억제합니다.
셀 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 200G을 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 펠릿을 1밀리리터의 MESCM에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 분리기를 사용하여 80 마이크로 리터의 세포 현탁액을 제조업체의 지침에 따라 4 개의 현미경 슬라이드에 균등하게 증착합니다.
약 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 그런 다음 PBS에서 0.2% Triton X-100을 사용하여 슬라이드의 세포를 15분 동안 투과시킵니다. 2% 소 혈청 알부민으로 세포를 1시간 동안 차단한 후 섭씨 4도에서 밤새 셰이커에서 1차 항체로 배양합니다.
배양 후 PBST로 슬라이드를 각각 5분씩 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 다음으로, 이전에 설명한 대로 결합되지 않은 항체를 세척하기 전에 섭씨 37도에서 1시간 동안 적절한 2차 항체로 샘플을 배양합니다. 밀리리터당 5마이크로그램의 농도를 갖는 DAPI로 핵을 대조염색합니다.
슬라이드를 밀봉한 후 형광 현미경을 사용하여 이미징을 수행합니다. RNA 분리 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 LNC에서 총 RNA를 추출합니다. 그런 다음 고용량 상보적 DNA 또는 CDNA 전사 키트를 사용하여 RNA의 1-2 마이크로그램을 역전사합니다.
2.5 마이크로 리터의 CDNA, 0.8 마이크로 리터의 해당 유전자 프라이머, 10 마이크로 리터의 범용 PCR 마스터 믹스 및 6.7 마이크로 리터의 이중 증류수를 포함하는 20 마이크로 리터 용액을 준비합니다. 그런 다음 적절한 조건을 사용하여 정량적 중합효소 연쇄 반응을 수행합니다. 마지막으로 비교 CT 기법을 사용하여 상대적인 유전자 발현을 검사합니다.
네 번째 통로 LNC의 이중 면역 염색은 이들 세포가 일관되게 panCK 음성, VIM 양성, CD90 양성, CD105 양성, SCF 양성 및 PDGFR 양성임을 명확하게 보여주었습니다.
